Строение бактериальной клетки

Размеры — от 1 до 15 мкм. Основные формы: 1) кокки (шаровидные), 2) бациллы (палочковидные), 3) вибрионы (изогнутые в виде запятой), 4) спириллы и спирохеты (спирально закрученные).

Бактериальная клетка ограничена оболочкой. Внутренний слой оболочки представлен цитоплазматической мембраной (1), над которой находится клеточная стенка (2); над клеточной стенкой у многих бактерий — слизистая капсула (3). Строение и функции цитоплазматической мембраны эукариотической и прокариотической клеток не отличаются. Мембрана может образовывать складки, называемые мезосомами (7). Они могут иметь разную форму (мешковидные, трубчатые, пластинчатые и др.).

На поверхности мезосом располагаются ферменты. Клеточная стенка толстая, плотная, жесткая, состоит из муреина (главный компонент) и других органических веществ. Муреин представляет собой правильную сеть из параллельных полисахаридных цепей, сшитых друг с другом короткими белковыми цепочками. В зависимости от особенностей строения клеточной стенки бактерии подразделяются на грамположительные (окрашиваются по Граму) и грамотрицательные (не окрашиваются). У грамотрицательных бактерий стенка тоньше, устроена сложнее и над муреиновым слоем снаружи имеется слой липидов. Внутреннее пространство заполнено цитоплазмой (4).


Генетический материал представлен кольцевыми молекулами ДНК. Эти ДНК можно условно разделить на «хромосомные» и плазмидные. «Хромосомная» ДНК (5) — одна, прикреплена к мембране, содержит несколько тысяч генов, в отличие от хромосомных ДНК эукариот она не линейная, не связана с белками. Зона, в которой расположена эта ДНК, называется нуклеоидом. Плазмиды — внехромосомные генетические элементы. Представляют собой небольшие кольцевые ДНК, не связаны с белками, не прикреплены к мембране, содержат небольшое число генов. Количество плазмид может быть различным. Наиболее изучены плазмиды, несущие информацию об устойчивости к лекарственным препаратам (R-фактор), принимающие участие в половом процессе (F-фактор). Плазмида, способная объединяться с хромосомой, называется эписомой.

В бактериальной клетке отсутствуют все мембранные органоиды, характерные для эукариотической клетки (митохондрии, пластиды, ЭПС, аппарат Гольджи, лизосомы).

В цитоплазме бактерий находятся рибосомы 70S-типа (6) и включения (9). Как правило, рибосомы собраны в полисомы. Каждая рибосома состоит из малой (30S) и большой субъединиц (50S). Функция рибосом: сборка полипептидной цепочки. Включения могут быть представлены глыбками крахмала, гликогена, волютина, липидными каплями.


У многих бактерий имеются жгутики (10) и пили (фимбрии) (11). Жгутики не ограничены мембраной, имеют волнистую форму и состоят из сферических субъединиц белка флагеллина. Эти субъединицы расположены по спирали и образуют полый цилиндр диаметром 10–20 нм. Жгутик прокариот по своей структуре напоминает одну из микротрубочек эукариотического жгутика. Количество и расположение жгутиков может быть различным. Пили — прямые нитевидные структуры на поверхности бактерий. Они тоньше и короче жгутиков. Представляют собой короткие полые цилиндры из белка пилина. Пили служат для прикрепления бактерий к субстрату и друг к другу. Во время конъюгации образуются особые F-пили, по которым осуществляется передача генетического материала от одной бактериальной клетки к другой.

Спорообразование у бактерий — способ переживания неблагоприятных условий. Споры формируются обычно по одной внутри «материнской клетки» и называются эндоспорами. Споры обладают высокой устойчивостью к радиации, экстремальным температурам, высушиванию и другим факторам, вызывающим гибель вегетативных клеток.

Размножение. Бактерии размножаются бесполым способом — делением «материнской клетки» надвое. Перед делением происходит репликация ДНК.


Редко у бактерий наблюдается половой процесс, при котором происходит рекомбинация генетического материала. Следует подчеркнуть, что у бактерий никогда не образуются гаметы, не происходит слияние содержимого клеток, а имеет место передача ДНК от клетки-донора к клетке-реципиенту. Различают три способа передачи ДНК: конъюгация, трансформация, трансдукция.

Конъюгация

Конъюгация — однонаправленный перенос F-плазмиды от клетки-донора в клетку-реципиента, контактирующих друг с другом. При этом бактерии соединяются друг с другом особыми F-пилями (F-фимбриями), по каналам которых фрагменты ДНК и переносятся. Конъюгацию можно разбить на следующие этапы: 1) раскручивание F-плазмиды, 2) проникновение одной из цепей F-плазмиды в клетку-реципиента через F-пилю, 3) синтез комплементарной цепи на матрице одноцепочечной ДНК (происходит как в клетке-доноре (F+), так и в клетке-реципиенте (F)).

Трансформация — однонаправленный перенос фрагментов ДНК от клетки-донора к клетке-реципиенту, не контактирующих друг с другом. При этом клетка-донор или «выделяет» из себя небольшой фрагмент ДНК, или ДНК попадает в окружающую среду после гибели этой клетки. В любом случае ДНК активно поглощается клеткой-реципиентом и встраивается в собственную «хромосому».

Трансдукция — перенос фрагмента ДНК от клетки-донора к клетке-реципиенту с помощью бактериофагов.

Вирусы

iv>

Вирусы открыты в 1892 г. Д.И. Ивановским при изучении мозаичной болезни табака (пятнистость листьев). Вирусы — неклеточные формы жизни. Проявляют признаки, характерные для живых организмов, только во время паразитирования в клетках других организмов. Вирусы являются внутриклеточными паразитами, но, в отличие от других паразитов, они паразитируют на генетическом уровне (ультрапаразиты). Существует несколько точек зрения на происхождение вирусов: 1) вирусы возникли в результате дегенерации клеточных организмов; 2) вирусы можно рассматривать как группу «потерявшихся», вышедших из-под контроля клетки генов («осколок генома»); 3) вирусы произошли от клеточных органоидов и др.

Вирусы состоят из нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) и белков, образующих оболочку вокруг этой нуклеиновой кислоты, т.е. представляют собой нуклеопротеидный комплекс. В состав некоторых вирусов входят липиды и углеводы. Вирусы содержат всегда один тип нуклеиновой кислоты — либо ДНК, либо РНК. Причем каждая из нуклеиновых кислот может быть как одноцепочечной, так и двухцепочечной, как линейной, так и кольцевой.

Размеры вирусов — 10–300 нм. Форма вирусов: шаровидная, палочковидная, нитевидная, цилиндрическая и др.


Капсид — оболочка вируса, образована белковыми субъединицами, уложенными определенным образом. Капсид защищает нуклеиновую кислоту вируса от различных воздействий, обеспечивает осаждение вируса на поверхности клетки-хозяина. Суперкапсид характерен для сложноорганизованных вирусов (ВИЧ, вирусы гриппа, герпеса). Возникает во время выхода вируса из клетки-хозяина и представляет собой модифицированный участок ядерной или наружной цитоплазматической мембраны клетки-хозяина.

Если вирус находится внутри клетки-хозяина, то он существует в форме нуклеиновой кислоты. Если вирус находится вне клетки-хозяина, то он представляет собой нуклеопротеидный комплекс, и эта свободная форма существования называется вирионом. Вирусы обладают высокой специфичностью, т.е. они могут использовать для своей жизнедеятельности строго определенный круг хозяев.

Бактериофаг

Вирусы, паразитирующие в бактериальных клетках, называются бактериофагами. Бактериофаг состоит из головки, хвостика и хвостовых отростков, с помощью которых он осаждается на оболочке бактерий. В головке содержится ДНК или РНК. Фаг частично растворяет клеточную стенку и мембрану бактерии и за счет сократительной реакции хвостика «впрыскивает» свою нуклеиновую кислоту в ее клетку.

Только паразитируя в клетке-хозяине, вирус может репродуцироваться, воспроизводить себе подобных.

В цикле репродукции вируса можно выделить следующие стадии.

>
  1. Осаждение на поверхности клетки-хозяина.
  2. Проникновение вируса в клетку-хозяина (могут попасть в клетку-хозяина путем: а) «инъекции», б) растворения оболочки клетки вирусными ферментами, в) эндоцитоза; попав внутрь клетки вирус переводит ее белок-синтезирующий аппарат под собственный контроль).
  3. Встраивание вирусной ДНК в ДНК клетки-хозяина (у РНК-содержащих вирусов перед этим происходит обратная транскрипция — синтез ДНК на матрице РНК).
  4. Транскрипция вирусной РНК.
  5. Синтез вирусных белков.
  6. Синтез вирусных нуклеиновых кислот.
  7. Самосборка и выход из клетки дочерних вирусов. Затем клетка либо погибает, либо продолжает существовать и производить новые поколения вирусных частиц.

Вирус ВИЧ

Вирусы способны паразитировать в клетках большинства существующих живых организмов, вызывая различные заболевания (грипп, коревая краснуха, полиомиелит, СПИД, оспа, бешенство и др.). Возбудитель СПИДа — вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) — относится к ретровирусам. Имеет сферическую форму, диаметром 100–150 нм. Наружная оболочка вируса состоит из мембраны, образованной из клеточной мембраны клетки-хозяина. В мембрану встроены рецепторные «грибовидные» образования. Под наружной оболочкой располагается сердцевина вируса, имеющая форму усеченного конуса и образованная особыми белками. Внутри сердцевины располагаются две молекулы вирусной РНК. Каждая молекула РНК содержит 9 генов ВИЧ и фермент (обратная транскриптаза), осуществляющий синтез вирусной ДНК на матрице вирусной РНК.


Вирус иммунодефицита человека поражает главным образом CD4-лимфоциты (хелперы), на поверхности которых есть рецепторы, способные связываться с поверхностным белком ВИЧ. Кроме того, ВИЧ проникает в клетки ЦНС, нейроглии, кишечника. Иммунная система организма человека утрачивает свои защитные свойства и оказывается не в состоянии противостоять возбудителям различных инфекций. Средняя продолжительность жизни инфицированного человека составляет 7–10 лет.

Источником заражения служит только человек — носитель вируса иммунодефицита. СПИД передается половым путем, через кровь и ткани, содержащие вирус иммунодефицита, от матери к плоду.

 

Источник: licey.net




Особенности строения бактериальной клетки. 

Основные органеллы:

Название

Химический состав

Строение

Функции

Метод обнаружения

Метод окраски

Клеточная стенка

Ригидные свойства клеточным стенкам придаёт пептидогликан.

У грамположительных бактерий наружный слой клеточной стенки содержит липопротеиды, гликопротеиды, тейхоевые кислоты, у них отсутствует липополисахаридный слой.

Многослойный пептидогликан (муреин, мукопептид) 40-90 % массы. Глицерофасфат, рибитолофосфат, липотейховые , тейовые и тейхуриновые кислоты, полисахариды , липиды , белки.

S- слой содержащий гликопротеиновые и протеиновые молекулы .

У грамотрицательных бактерий наружный пластический слой четко выражен, содержит липопротеиды, ипополисахаридный слой, состоящий из липида А (эндотоксина) и полисахарида (О-антигена).  Внутренний слой наружной мембраны представлен фосфолипидами

Клеточная стенка имеет два слоя:

1) наружный – пластичный;

2) внутренний – ригидный

Пептидогликан представлен параллельно расположенными молекулами гликана, состоящего из повторяющихся остатков N-ацетилглюкозомина и N- ацетилмурамовой кислоты, соединённой гликозидной связью . Эти связи разрывает лизоцим.

Клеточная стенка- ригидное защитное образование, обеспечивающие взаимодействие с факторами окружающей среды 1) защитную, осуществление фагоцитоза;

2) регуляцию осмотического давления;

3) рецепторную;

4) принимает участие в процессах питания деления клетки;

5) антигенную (определяется продукцией эндотоксина– основного соматического антигена бактерий);

6) стабилизирует форму и размер бактерий;

7) обеспечивает систему коммуникаций с внешней средой;

8) косвенно участвует в регуляции роста и деления клетки.

Клеточная стенка при обычных способах окраски не видна, но если клетку поместить в гипертонический раствор (при опыте плазмолиза), то она становится видимой.

При окраске по Грамму многослойный пептидогликан удерживает комплекс красителей в виде генциафиолетового и йода : при кратковременной обработке спиртом бактерии остаются окрашенными в сине-фиолетовый цвет . Наоборот грамотрицательные бактерии обесвечиваются спиртом ,поэтому последующая обработка мазка водным фуксином или сафарином окрашивает бактерии в красный цвет.

Цитоплазматическая мембрана

Имеет обычное строение: два слоя фосфолипидов (25–40 %) , поверхностные и интегральные белки.

По структуре она похожа на плазмолемму клеток животных и состоит из двойного слоя липидов , главным образом фосфолипидов , с внедрёнными поверхностными , а так же интегральными белками, как бы пронизывающими насквозь структуру мембраны.

Она обладает избирательной проницаемостью, принимает участие в транспорте питательных веществ, выведении экзотоксинов, энергетическом обмене клетки, является осмотическим барьером, участвует в регуляции роста и деления, репликации ДНК, является стабилизатором рибосом.

При электронном микрокопировании ультратонких срезов представляет собой трехслойную мембрану( 2 темных слоя по 2,5 нм разделены светлым –промежуточным.

Электронограмма бактрерии.

Цитоплазма

Растворимые белки , рибонуклеиновые кислоты , включения и многочисленные мелкие гранул –рибосом, ответственных за синтез белков. Гликоген, полисахариды , бетаоксимаслянная кислота, полифосфаты(волютин), вода 50-60%.

Имеет жидкую структуру в которой находится её компоненты представленные различными включениями в виде гранул гликогена , полисахаридов и полифосфатов.

1)объединение всех компонентов клетки в единую среду

2)среда для прохождения химических реакций

3)среда для существования и функционирования органоидов.

Легко выявляется с помощью выявляется с помощью специальных методов окраски (например по Нейссеру) в виде метахроматических гранул.

Метод окраски по Нейссеру

Нуклеоид

Двунитевая ДНК замкнутая в кольцо

Нуклеоид- эквивалент ядра у бактерий . Он расположен в центральной зоне бактерий в виде двунитевой ДНК, замкнутой в кольцо и плотно уложенной в клубок.

Участвует в делении клетки , а так же хранит и передаёт наследственную информацию.

Нуклеоид выявляется в световом микроскопе после окраски специфическими для ДНК методами по Фельгену или Романовскому-Гимзе.

Метод окраски по Фельгену или Романовскому –Гимзе.

Плазмиды

Ковалентно замкнутые кольца ДНК.

Внехромосомные факторы наследственности –представляющие собой ковалентно замкнутые кольца ДНК., расположенные в цитоплазме или интегрированные с хромомсомой.

Устойчивость к антибиотикам (R плазмиды) , способность к передаче наследственного материала при конъюгации(F плазмиды) , продукция бактериоцинов, в частности колицинов , подавляющих рост других бактерий (Col плазмиды).

Выявляется с помощью специальных методов окраски.

Метод Фельгена . Подготовка реактива Шифа . Получаем окраску в красный цвет.

Рибосомы

рибонуклеиновые кислоты (РНК) 16S pPHK (входящую в состав малой субъединицы) и 23SрРНК (входящую в состав большой субъедин. Белок.

Рибосомы бактерий имеют размер около 20нм и коэфицент седиментации 70S.Могут диссоциировать на 2 субъединицы 50S и 30S.

На рибосомах происходит синтез белка и полипептидных молекул..

Микроскопическое исследование с помощью электронного микроскопа.

Дополнительные органеллы:

Капсула, микрокапсула, слизь.

Капсула:Полисахариды, полипептиды.

Слизь: мукойдные полисахариды не имеющие четких внешних границ.

Капсула- слизистая структура толщиной более 0,2 мкм, прочно связанная с клеточной стенкой бактерий и имеющая четко очерченные внешние границы. Капсула гидрофильна , включает большое количество воды.

Капсула и слизь предохраняет бактерии от повреждений , высыхания , так как , являясь гидрофильными хорошо связывают воду , препятствуют действию защитных факторов макроорганизмов гликокаликсом.

Капсула выявляется при специальных методах окраски мазка по Бурри-Гинсу. Создающих негативное контрастирование веществ капсулы: тушь создаёт тёмный фон вокруг капсулы.

Метод окраски по Бурри-Гинсу.

Жгутики

Белок Флаггелин являющимся антигеном – так называемый H -антиген.

Это особые белковые выросты на поверхности бактериальной клетки, содержащие белок – флагелин. Количество и расположение жгутиков может быть различным. Толщина 12-20нм, длина 3-15мкм.Состоят из трёх частей, спиралевидной нити , крюка и базального тельца , содержащего стержень со специальными дисками. Дисками жгутики прикреплены к цитоплазматической мембране и клеточной стенке.

Обеспечение подвижности бактериальной клетки. Механизм вращения обеспечивает протонная АТФ-синтетаза. Скорость вращения жгутика может достигать 100 об/сек.

Жгутики выявляются с помощью электронной микроскопии препаратов, напыленных тяжелыми металлами , или в световом микроскопе после обработки специальными методами, основанными на протравливании и адсорбции различных веществ, приводящих к увеличению толщины жгутиков. Например , после серебрения .

Метод окраски по Леффлеру. Различные оттенки от жёлтого до тёмно-коричневого. Препарат висячей капли. Электронограмма бактерии, напыление металлом.

Ворсинки или Пили

Белок Пилин.

Нитевидные образования , более тонкие и короткие чем жгутики. Пили отходят от поверхности клетки и состоят из белка пилина , обладающего антигенной активностью. Различают пили , ответственные за прикрепление, питание , водосолевой обмен и половые. Несколько сотен пили на клетку.

Различают пили , ответственные за прикрепление, питание , водосолевой обмен и половые пили. Многие пили являются рецепторами для бактериофагов.

Фазово-контрастная микроскопия препаратов.

По методу Морозова.

Споры

Дипилоколинат кальция (оболочка),липопротеины, кератиноподобные белки, 3глицеринфосфат (энергия вместо АТФ)

Форма спор может быть овальной , шаровидной, расположение –терминальное , субтерминальное и центральное. Снаружи спора имеет тонкий экзоспориум, под которым расположена оболочка споры ,а под ней кортекс, состоящий из пептидогликана .Внутри кортекса находится клеточная стенка спор.

Споры образуются при неблагоприятных условиях, УФ-облучение, дефицит питательных веществ. Защитная функция.

Для обнаружения используют специальные методы окраски.

Споры кислотоустойчивы по этому окрашиваются по методу Ауески или по методу Циля-Нельсена в красный, а вегетативная клетка в синий цвет.

Источник: StudFiles.net

Таблица. Органоиды клетки и их функции

В этой таблице рассматриваются все имеющиеся органоиды клетки, как растительной, как и животной.

 Органоид (Органелла) Строение Функции
 Цитоплазма  Внутренняя полужидкая субстанция, основа клеточной среды, образована мелкозернистой структурой. Содержит ядро и набор органоидов.  Взаимодействие между ядром и органоидами. Транспорт веществ.
 Ядро Шаровидной или овальной формы. Образовано ядерной оболочкой, состоящей из двух мембран, имеющих поры. Имеется полужидкая основа, называемая кариоплазма или клеточный сок.Хроматин или нити ДНК, образуют плотные структуры, называемые хромосомами.

Ядрышки – мельчайшие, округлые тельца ядра.

Регулирует все процессы биосинтеза, такие как обмена веществ и энергии, осуществляет передачу наследственной информации.Кариоплазма ограничивает ядро от цитоплазмы, кроме того, дает возможность осуществлять обмен между непосредственно ядром и цитоплазмой.

В ДНК заключена наследственная информация клетки, поэтому ядро – хранитель всей информации об организме.

В ядрышках синтезируются РНК и белки, из которых образуются в последствие рибосомы.

 Клеточная мембрана  Образована мембрана двойным слоем липидов, а также белком. У растений снаружи покрыта дополнительно слоем клетчатки.  Защитная, обеспечивает форму клеток и клеточную связь, пропускает внутрь клетки необходимые вещества и выводит продукты обмена. Осуществляет процессы фагоцитоза и пиноцитоза.
 ЭПС (гладкая и шероховатая) Образована эндоплазматическая сеть системой каналов в цитоплазме. В свою очередь, гладкая эпс образована, соответственно, гладкими мембранами, а шероховатая ЭПС – мембранами, покрытыми рибосомами. Осуществляет синтез белков и некоторых других органических веществ, а также является главной транспортной системой клетки.
 Рибосомы  Отростки шероховатой мембраны эпс шарообразной формы.  Главная функция – синтез белков.
 Лизосомы  Пузырек, окруженный мембраной.  Пищеварение в клетке
 Митохондрии  Покрыты наружной и внутренней мембранами. Внутренняя мембрана имеет многочисленные складки и выступы, называемые кристами  Синтезирует молекулы АТФ. Обеспечивает клетку энергией.
 Пластиды  Тельца, окруженные двойной мембраной. Различают бесцветные (лейкопласты) зеленые (хлоропласты) и красные, оранжевые, желтые (хромопласты) Лейкопласты — накапливают крахмал.Хлоропласты — участие в процессе фотосинтеза.

Хромопласты — Накапливание каратиноидов.

 Клеточный Центр  Состоит из центриолей и микротрубочек  Участвует в формировании цитоскелета. Участие в процессе деления клетки.
 Органоиды движения  Реснички, жгутики  Осуществляют различные виды движения
 Комплекс (аппарат) Гольджи  Состоит из полостей, от которых отделяются пузырьки разных размеров  Накапливает вещества, которые синтезируются собственно клеткой. Использование этих веществ или вывод во внешнюю среду.

Источник: life-students.ru

Что такое органоиды клетки

Органоиды клетки, они же органеллы, представляют собой специализированные структуры собственно клетки, отвечающие за различные важные и жизненно необходимые функции. Почему же все-таки «органоиды»? Просто тут эти компоненты клетки сопоставляются с органами многоклеточного организма.

Какие органоиды входят в состав клетки

Также порой под органоидами понимается исключительно лишь постоянные структуры клетки, которые находятся в ее цитоплазме. По этой же причине ядро клетки и ее ядрышко не называют органоидами, равно как и не являются органоидами клеточная мембрана, реснички и жгутики. А вот к органоидам, входящим в состав клетки относятся: хромосомы, митохондрии, комплекс Гольджи, эндоплазматическая сеть, рибосомы, микротрубочки, микрофиламенты, лизосомы. По сути это и есть основные органоиды клетки.

Если речь идет о животных клетках, то в число их органоидов также входят центриоли и микрофибриллы. А вот в число органоидов растительной клетки еще входят только свойственные растениям пластиды. В целом состав органоидов в клетках может существенно отличатся в зависимости от вида самой клетки.

строение клетки

Рисунок строения клетки, включая ее органоиды.

Двумембраные органоиды клетки

Также в биологии существует такое явление как двумембраные органоиды клетки, к ним относятся митохондрии и пластиды. Ниже мы опишем свойственные им функции, впрочем, как всех других основных органоидов.

Функции органоидов клетки

А теперь коротко опишем основные функции органоидов животной клетки. Итак:

  • Плазматическая мембрана – тонкая пленка вокруг клетки состоящая из липидов и белков. Очень важный органоид, который обеспечивает транспортировку в клетку воды, минеральных и органических веществ, удаляет вредные продукты жизнедеятельности и защищает клетку.
  • Цитоплазма – внутренняя полужидкая среда клетки. Обеспечивает связь между ядром и органоидами.
  • Эндоплазматическая сеть – она же сеть каналов в цитоплазме. Принимает активное участие в синтезе белков, углеводов и липидов, занимается транспортировкой полезных веществ.
  • Митохондрии – органоиды, в которых окисляются органические вещества и синтезируются молекулы АТФ с участием ферментов. По сути митохондрии это органоид клетки, синтезирующий энергию.
  • Пластиды (хлоропласты, лейкопласты, хромопласты) – как мы упоминали выше, встречаются исключительно у растительных клеток, в целом их наличие является главной особенностью растительного организма. Играют очень важную функцию, например, хлоропласты, содержащие зеленый пигмент хлорофилл, у растения отвечают за явление фотосинтеза.
  • Комплекс Гольджи — система полостей, отграниченных от цитоплазмы мембраной. Осуществляют синтез жиров и углеводов на мембране.
  • Лизосомы — тельца, отделенные от цитоплазмы мембраной. Имеющиеся в них особые ферменты ускоряют реакцию расщепления сложных молекул. Также лизосома является органоидом, обеспечивающим сборку белка в клетках.
  • Вакуоли — полости в цитоплазме, заполненные клеточным соком, место накопления запасных питательных веществ; они регулируют содержание воды в клетке.

В целом все органоиды являются важными, ведь они регулируют жизнедеятельность клетки.

Источник: www.poznavayka.org