Нередко в цитоплазме бактерий обнаруживаются различные включения, которые образуются в процессе жизнедеятельности: капельки нейтральных липидов, воска, серы, гранулеза (сферическое запасное углеводное вещество, накапливающееся у бактерий рода Clostridium), гранулы гликогена, β-гидроксимасляной кислоты – ПОМ (особенно у рода Bacillus). Гранулеза, гликоген, ПОМ служат для бактерий запасным источником энергии. У некоторых бактерий в цитоплазме находятся кристаллы белковой природы, обладающие ядовитым действием на насекомых.

Некоторые бактерии способны накапливать фосфорную кислоту в виде гранул полифосфата (зерна волютина, метахроматические зерна, зерна Бабеша-Эрнста). Они играют роль фосфатных депо и регулярно выявляются у коринебактерий, микобактерий и спирилл в виде плотных, хорошо контурированных образований в форме шара или эллипса, располагающихся, в основном, у полюсов клетки. Обычно на полюсах бывает по одной грануле.

Наличие зерен волютина у бактерий определяют методом Нейссера.

Метод окраски по Нейссеру

  1. Фиксированный мазок окрашивают уксуснокислой синей 4 мин, затем сливают краску.

  2. Промывают водой и наливают раствор Люголя на 20-30 сек.

  3. Не промывая водой, окрашивают везувином 1-3 мин.

  4. Промывают водой, высушивают.


Тела бактерий окрашиваются в нежный светло-коричневый цвет, зерна волютина — в темно-синий, почти черный цвет.

Нуклеоид

Нуклеоид – ядерный аппарат бактерий. Представлен молекулой ДНК, соответствующей одной хромосоме. Она циркулярно замкнута, располагается в ядерной вакуоле, не имеет ограничивающей от цитоплазмы мембраны и митотического аппарата.

С ДНК связано небольшое количество РНК и РНК-полимеразы. ДНК свернуто вокруг центрального стержня, состоящего из РНК и представляет собой высокоупорядоченную компактную структуру. Хромосомы большинства прокариот имеют молекулярную массу в пределах 1-3х109, константу седиментации 1300-2000 S. Молекула ДНК включает 1,6х107нуклеотидных пар. Различия в генетическом аппарате прокариотных и эукариотных клеток обуславливает его название: у первых – нуклеоид (образование подобное ядру), в отличие от ядра у вторых.

В нуклеоиде бактерий содержится основная наследственная информация, которая реализуется в синтезе специфических белковых молекул. С ДНК бактериальной клетки связаны системы репликации, репарации, транскрипции и трансляции.


Нуклеоид в прокариотной клетке может быть выявлен в окрашенных препаратах с помощью светового или фазово-контрастного микроскопа. Для окрашивания ядерного вещества используется краситель Фельгена, который специфически окрашивает ДНК.

У многих бактерий в цитоплазме обнаружены внехромосомные генетические элементы – плазмиды. Они представляют собой замкнутые в кольца двухцепочечные ДНК, состоящие из 1500-40 000 пар нуклеотидов и содержащие до 100 генов.

Плазмиды могут существовать в клетке и в интегрированном состоянии с бактериальной хромосомой, сохраняя при этом способность переходить к автономии.

Капсула

Капсула – слизистый слой клеточной стенки бактерий, состоящий из полисахаридов (пневмококк) или полипептидов (бацилла сибирской язвы). Микрокапсулу (толщиной менее 0,2 мкм) способны формировать большинство бактерий, четко выраженную макрокапсулу (толщиной более 0,2 мкм) формируют пневмококк, клебсиеллы, возбудитель сибирской язвы и некоторые другие. У патогенных бактерий капсула образуется в макроорганизме, на искусственных питательных средах она обычно утрачивается (за исключением клебсиелл).

В организме человека и животных капсула защищает патогенные бактерии от бактериофага, фагоцитоза и гуморальных факторов иммунитета, определяет антигенную специфичность микроорганизмов.

Капсулы, имея консистенцию геля, плохо удерживают краситель, и для их выявления чаще всего применяют методы негативного контрастирования.

Метод выявления капсулы по Бурри-Гинсу


  1. На середину предметного стекла наносят каплю черной туши и смешивают ее с помощью петли с каплей культуры капсульных бактерий.

  2. Краем другого предметного стекла делают мазок по типу кровяного. Мазок сушат на воздухе и фиксируют в пламени горелки.

  3. Окрашивают 5 мин карболовым фуксином, разведенным водой 1:3.

  4. Осторожно промывают водой, высушивают.

Бактерии окрашиваются в красный цвет, неокрашенные капсулы контрастно выделяются на темном фоне препарата.

Источник: StudFiles.net

   Цитоплазма  — это содержимое клетки, окруженное цитоплазматической мембраной. Гомогенная фракция цитоплазмы, содержащая растворимые компоненты РНК, ферментные белки, вещества субстрата и продукты метаболических реакций, получила название цитозоля. Вторая фракция цитоплазмы представлена структурными элементами: рибосомами, внутрицитоплазматическими включениями и нуклеоидом.

   Рибосомы прокариот имеют константу седиментации 70 S.  Диаметр рибосом составляет 15-20 нм.

iv>
и образованы двумя субъединицами: 30S и 50S. Меньшая субъединица — 30S – включает одну молекулу 16S РНК с молекулярной массой около 5,5х10 5   и 21 молекулу белков. Большая субъединица – 50 S – содержит 2 молекулы РНК (23S и 5,5S с молекулярными массами 1,1х10 6  и 0,4 х 10 5 ) и 34 молекулы белков. Для объединения субъединиц в димер рибосомы необходимы ионы  Mg 2+  .  Число рибосом в бактериальной клетке может быть разным. Так, в быстрорастущей клетке Escherichia coli насчитывается около 15000 рибосом. Процесс биосинтеза белка в клетке осуществляется полисомами. Иногда в полисоме насчитывается несколько десятков рибосом, что свидетельствует об их высокой белок-синтезирующей активности.  Рибосомы бактериального 70S типа входят в состав органоидов эукариот – митохондрий и хлоропластов.

   Цитоплазматические включения  бактериальной клетки подразделяются на включения, окруженные белковой мембраной и включения, лишенные белковой мембраны. Аэросомы (газовые вакуоли), имеющие белковую оболочку, обнаружены только в клетках прокариот. Аэросомы характерны для многих бактерий, обитающих в водоемах и илах.  Аэросомы имеют сотоподобную структуру, представленную массой газовых пузырьков, каждый из которых имеет форму цилиндра длиной 200-1000 нм и диаметром около 75 нм.  Пузырьки ограничены однослойной белковой мембраной толщиной 2 нм и заполнены газом.  Состав газа аэросом аналогичен составу газов в окружающей среде. Аэросомы, снижая  удельную массу бактериальной клетки, поддерживают ее во взвешенном состоянии в водоеме. Бактерии, имеющие аэросомы , обычно являются обитателями планктона.


   В клетках  зеленых бактерий к внутрицитоплазматическим включениям относятся хлоросомы.  Они имеют форму продолговатых пузырьков длиной 90 – 150 нм и диаметром 25 – 70 нм.  Хлоросомы окружены однослойной белковой мембраной, в них локализованы бактериохлорофиллы, поглощающие световую энергию.

   В клетках цианобактерий присутствуют фикобилисомы, содержащие водорастворимые пигменты белковой природы – фикобилипротеиды.

   К внутриплазматическим включениям в клетках некоторых фототрофных и хемотрофных бактерий, а также всех цианобактерий относятся карбоксисомы, или полиэдрические тела. Кроме того, внутрицитоплазматическими включениями бактериальной  клетки являются запасные вещества – полифосфаты, полисахариды, поли-ß-оксимасляная кислота и отложения серы.  В условиях голодания запасные вещества являются источником энергии и питания бактерий. В клетках бактерий может накапливаться одно запасное вещество или несколько разных по химической природе веществ. Например, клетки Escherichia coli запасают гликоген.

   В клетках некоторых видов рода Bacillus в спорангиях рядом со спорой обнаружены кристаллоподобные   включения, получившие название параспоральных телец. Они имеют ромбовидную или кубовидную форму и состоят из белка, токсичного для личинок насекомых.

>

Источник: students-library.com

Включения — это непостоянные (необязательные) структурные элементы цитоплазмы.

Они заметны при световой микроскопии при общих методах окрашивания, иногда при малом и среднем увеличении, а часть из них можно выявить лишь специальными (гистохимическими, иммунологическими) методами или при электронной микроскопии. В зависимости от активности клетки, гормональных и метаболических влияний, особенностей дифференцировки, возраста, действия разнообразных факторов внешней среды в клетках можно обнаружить большое разнообразие включений по составу и количеству.

Включения указывают на особенности метаболизма, дифференцировки, функциональной активности клеток. Много включений появляется при дистрофических нарушениях в клетке, что сопровождается изменениями в ее жизнедеятельности вплоть до гибели. Иногда содержимое включений не только показатель функции, но основание для названия клетки: пигментные клетки — меланоциты; эозинофильные, базофильные и нейтрофильные гранулоциты крови и др.

При всем многообразии включений их можно объединить по их функциональному назначению.

Секреторные включения. Представляют собой секреторные гранулы, которые выделяются из клетки путем экзоцитоза. По химическому составу их подразделяют на белковые (серозные), жировые (липидные, или липосомы), слизистые (содержат мукополисахариды) и др. Количество включений зависит от функциональной активности клетки, стадии секреторного цикла, степени зрелости клетки. Особенно много гранул в дифференцированных, функционально активных клетках в фазу накопления секреторного цикла.


Секреторные включения образуются в комплексе Гольджи. Перед этим они проходят стадию синтеза в гр. или глад. ЭПС, реже это происходит в других структурах.

Секреторные белковые включения разнообразны по своим размерам, распределению в цитоплазме, электронной плотности. Они окружены клеточной мембраной. Полипептидные цепочки содержимого секреторных включений синтезируются в гр. ЭПС, а созревают в комплексе Гольджи. В связи с этим у клеток, синтезирующих секреторные белки, хорошо развиты данные органеллы, крупное ядро и ядрышки. Однако если клетка прекращает синтез включений, их накопление сопровождается инволюцией гр. ЭПС и комплекса Гольджи.

В экзокринных железах секреторные включения преобладают в апикальной части клетки, предполагая выведение секрета во внешнюю среду. Секреторные включения эндокринных желез концентрируются вблизи кровеносных сосудов или равномерно распределены в цитоплазме.

Слизистые секреторные включения находятся в основном в клетках слизистых секреторных желез. Примером одноклеточных секреторных желез служат бокаловидные клетки тонкой кишки. При световой микроскопии с помощью ШИК-реакции слизь хорошо видна в крупных вакуолях.

Секреторные включения, содержащие жиры (липосомы), имеются в цитоплазме сальных желез и эндокринных клеток, синтезирующих стероидные гормоны (производные холестерина). Стероидные гормоны — это мужские и женские половые гормоны, гормоны стресса (глюкокортикоиды) и гормон, контролирующий содержание ионов натрия в организме (альдостерон). В этих клетках хорошо развита глад, и гр. ЭПС, комплекс Гольджи, много митохондрий. Митохондрии эндокриноцитов участвуют в синтезе стероидных гормонов и имеют специфические особенности строения. Это крупные митохондрии с мультивезикулярными (трубчатыми) кристами.


Также выделяют секреторные включения, содержащие производные аминокислот и других аминов: норадреналин и адреналин, серотонин (мелатонин) и др.

Разнообразен состав секреторных включений в тучной клетке (лаброците) и базофильном гранулоците (базофиле). Эти клетки содержат многочисленные крупные секреторные включения, окрашивающиеся основными красителями и нередко изменяющие их оттенок. Такая способность изменять цвет красителя называется метахромазией. При электронной микроскопии видно, что в лаброцитах и гранулоцитах много крупных гранул округлой формы, различной электронной плотности.

Количество включений зависит от стадии секреторного цикла. Максимально их количество на стадии накопления секрета, а на других стадиях они могут отсутствовать или их концентрация в клетке минимальна.

Трофические включения. Это структуры, в которых клетки и организм в целом запасают питательные вещества, необходимые в условиях энергетического дефицита, недостатка структурных молекул (при голодании). Примером трофических включений служат гранулы с гликогеном (печеночные клетки, мышечные клетки и симпласты), липидные включения в жировых и других клетках.


Трофические включения гликогена представляют собой мелкие, неправильной формы гранулы, которые можно обнаружить при электронной микроскопии, а также при световой микроскопии, используя специальные методы окрашивания. Гликоген при расщеплении превращается в глюкозу, которую используют клетка и организм в целом в условиях ее дефицита.

Липидные включения в норме накапливаются в жировой ткани (белом или буром жире). В липоците белого жира включения сливаются в гигантскую каплю, которая занимает всю центральную часть клетки. Такие клетки приобретают округлую форму, большие размеры. Ядра уплощены и смещены на периферию, органелл немного. В липоцитах бурого жира включения не сливаются в одну каплю, ядра лежат центрально, много митохондрий, развиты комплекс Гольджи и глад. ЭПС.

При переходе на жировой обмен разрушение липидов в жировых тканях поддерживает энергетические потребности организма. Липидные включения легче разрушаются в буром жире, чем в белом. Избыточное накопление липидов в жировой ткани называют ожирением.

Трофические липидные капли могут накапливаться вне жировых клеток: в гепатоцитах, скелетных и сердечных миоцитах, канальцевом аппарате почек и др. Большое накопление таких включений, которое носит обратимый характер и не нарушает функцию клетки, называется жировой инфильтрацией. В случае, когда такое накопление ведет к повреждению клетки, это явление называют жировой дистрофией. Жировая дистрофия стенки артерии — атеросклероз.


Пигментные включения. Этот тип включений придает окраску клеткам; обеспечивает защитную функцию, например, гранулы меланина в пигментных клетках кожи предохраняют от солнечных ожогов. Пигментные включения могут состоять из продуктов жизнедеятельности клетки: гранулы с липофусцином в нейронах, гемосидерин в макрофагах.

Пигментные клетки — меланоциты у низкоорганизованных позвоночных встречаются во многих органах, придавая животным разнообразную окраску. Форма клеток также различная, но в основном многоотростчатая.

У млекопитающих и человека меланоциты встречаются в основном в эпителии. В многослойном эпителии они лежат в базальном слое, а их отростки направляются к шиповатому слою. Пигмент включений меланоцитов — меланин является производным аминокислоты тирозина. Меланин накапливается в многочисленных включениях, располагающихся в теле и отростках клетки. Часть включений выделяется и захватывается соседними клетками. Если клетки не способны вырабатывать меланин, то это ведет к альбинизму.

Экскреторные включения. Это включения веществ, захватываемых клеткой из внутренней среды и выводимых из организма: токсические вещества, продукты метаболизма, инородные структуры. Нередко экскреторные включения встречаются в эпителии канальцев почки, в первую очередь в проксимальных. Проксимальные канальцы выводят ненужные организму вещества, которые не могут быть отфильтрованы через клубочковый аппарат.

Случайные включения. Характерны для фагоцитов, захватывающих чужеродные для организма структуры (частички пыли, бактерии и вирусы), плохо перевариваемые и неперевариваемые макромолекулярные органические и неорганические комплексы. Наиболее часто подобные включения обнаруживают в специализированных клетках, осуществляющих фагоцитоз, — нейтрофильных лейкоцитах и макрофагах.

Минеральные включения. Преимущественно это нерастворимые соли кальция (карбонаты, фосфаты). Они образуются при пониженной активности органа, гипотрофии и атрофии. Нередко минеральные включения (соли кальция) обнаруживают в матриксе митохондрий, это связано с высоким содержанием этого иона и изменением метаболизма в органелле.

Включения при патологии, могут накапливаться в избыточном количестве и вести к нарушению структуры и функции клетки (дистрофии). Дистрофия обусловлена болезнями накопления, связанными с недостаточной активностью лизосом и/или избыточным синтезом каких-либо веществ (жировая дистрофия печени, дистрофия нейронов, при накоплении большого количества гранул с липофусцином, гликогеноз печени и мышц и др.). Накапливаться могут как обычные для клетки вещества (гликоген в гепатоцитах), так и вещества, в норме в клетке не встречающиеся (амилоид).

Большинство включений отделено от матрикса цитоплазмы мембраной (секреторные включения, жировые трофические включения и др.). Однако есть и включения, которые соприкасаются с содержимым гиалоплазмы (гликоген, некоторые минеральные включения).

Происхождение включений разнообразно и зависит от их содержимого. Например, основная масса секреторных и трофических включений формируется в комплексе Гольджи или в ЭПС, а случайные включения, гранулы гемосидерина — продукты неполного переваривания и фагоцитоза.

Утилизация и удаление включений из клетки зависят от природы самого включения. Секреторные включения выводятся из клетки путем экзоцитоза; гликоген и липиды расщепляются ферментами клетки и во внеклеточную среду выводятся в виде продуктов метаболизма (глюкозы, глицерина, жирных кислот); меланин выделяет пигментная клетка, затем его захватывает и разрушает клетка Лангерганса.

Таким образом, включения представляют собой разные по происхождению, функциональному назначению и морфологии структуры. Их число, вид могут быть показателями особенностей дифференцировки и функционального состояния клеток.

Источник: www.activestudy.info

У многих бактерий, выращиваемых в определенных условиях, в результате обменных процессов в цитоплазме образуются отложения, которые называют включениями. Среди них – отложения жира, поли-b-гидрооксимасляной кислоты, полифосфатов, полисахаридов, серы и различных кристаллов. Для выявления этих включений, которые сильно преломляют свет, применяется несколько методов.

Включения волютина хорошо выражены у Spirillum volutans, Bacillus subtilis, а также у возбудителей сибирской язвы и дифтерии. Гранулы волютина имеют относительно крупные размеры, окрашиваются различными красителями, изменяя цвет последних.

Например, при окрашивании метиленовым синим волютин окрашивается в ярко-красный цвет. Такое явление получило название метахромазии. Гранулы волютина представлены полифосфатами – запасающимся веществом, которое служит источником фосфатных групп.

Окраска гранул волютина по Нейссеру.

Методика окрашивания.

1 На фиксированный мазок наносят 2 – 3 капли раствора метиленового синего по Нейссеру и окрашивают в течение 1 – 2 мин.

2 Краситель сливают, препарат промывают водой.

3 Мазок обрабатывают раствором Люголя в течение 20 – 30 с.

4 Не промывая препарат водой, мазок дополнительно окрашивают 2 – 3 мин 2 % раствором везувина (или хризоидина).

5 Краситель сливают, препарат промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют, используя иммерсионную систему. Цитоплазма окрашивается в желтый цвет, а гранулы волютина – в темно-синий.

 

Подвижность бактерий

Поступательное движение бактерий за счет жгутиков можно наблюдать во влажных препаратах, применяя в большинстве случаев светлопольный микроскоп. Наиболее эффективно наблюдение за подвижностью в темнопольном микроскопе.

На основании количества и характера расположения жгутиков на поверхности бактериальной клетки отнесите ее к одному из следующих типов: монотрихи (имеют только один жгутик, прикрепленный к одному полюсу клетки), лофотрихи (на одном из своих полюсов имеют пучок из 2-50 жгутиков), амфитрихи (пучки жгутиков имеются на каждом из полюсов бактериальной клетки), перитрихи (многочисленные жгутики расположены по всей поверхности клетки).

Чтобы убедиться, что жгутики действительно присущи данным микроорганизмам, а также определить их расположение (полярное, перитрихиальное, латеральное), требуются методы с применением окрашивания.

Для окрашивания жгутиков предложено несколько методов, общим этапом для которых является протравливание препарата (обычно растворами таннина, KAl(SO4)2, HgCl2) и последующая окраска (чаще карболовым раствором фуксина). В результате этого на жгутиках происходит осаждение красителя, благодаря чему одновременно достигается как увеличение их толщины, так и уменьшение прозрачности. Одним из предложенных методов окрашивания жгутиков является метод Лейфзона.

Методика окрашивания.

1 Выращенные на скошенном агаре бактерии, осторожно ресуспендируют в пептонной воде. Бактериальной петлей суспензию наносят на предметное стекло и высушивают на воздухе.

2 Восковым стеклографом очерчивают вокруг бактериальной пленки прямоугольник.

3 Наносят на предметное стекло 1 мл раствора красителя таким образом, чтобы он не вытекал за пределы восковой линии. Оставляют краситель на определенное время (до 1 часа). В состав красителя входят 1,5 % хлористого натрия, 3 % таннина (дубильной кислоты) и 0,03 % фуксина.

4 Как только на поверхности красителя образуется золотистая пленка, а по всему мазку выпадет осадок, краситель удаляют под струей воды, а препарат высушивают на воздухе.

5 Препарат микроскопируют с иммерсионной системой. Клетки бактерий окрашиваются в красный цвет, жгутики принимают вид толстых нитей, отходящих от клетки.

Подвижность бактерий может быть выявлена с использованием техники посева в столбик агара. При этом культуру бактерий засевают уколом в столбик 0,3 % питательной среды в пробирке. Пробирки помещают в термостат для инкубирования. Результаты учитывают через 24 – 48 часов. Подвижные бактерии растут по всей толще агара, вызывая диффузное помутнение среды, неподвижные – только по линии укола.

 

Задание к лабораторной работе

1 Выявить наличие капсул бактерий при помощи метода Гинса – Бурри (метод негативного контрастирования).

2 Методом Шефера – Фултона изучить наличие и расположение эндоспор бактерий.

3 Цитоплазматические включения гранул волютина изучить методом окраски по Нейссеру.

4 Методом Лейфзона выявить наличие жгутиков на теле бактерий. На основании количества и характера расположения жгутиков на поверхности бактериальной клетки определить ее тип.

5 Результаты опытов зарисовать, сделать выводы.

Вопросы к защите лабораторной работы

1 Строение бактериальной клетки.

2 Цитоплазматические включения. Химический состав, назначение, способы окраски.

3 Перечислите органоиды, которые можно отнести к необязательным органоидам бактериальной клетки. Назовите их химический состав, функции.

4 Капсула бактерий. Химический состав, функции, способы окраски.

5 Типы передвижения бактериальных клеток. Способы окраски жгутиков.

 

Источник: megaobuchalka.ru