head-lymphocyte_destroying_cancer_cell_0203

Биологическая клетка – это сложный и крайне интересный объект, по сути своей она является целым организмом, который рождается, дышит, питается, размножается и умирает. Но это не удивительно, ведь огромная часть живых существ на нашей планете состоят только из одной клетки. После поста об антиоксидантах и активных формах кислорода, мне захотелось написать про такой мрачный, но нужный процесс как запрограммированная смерть клеток – по научному апоптоз. Стоит отличать апоптоз от некроза, который является гибелью клеток в результате травмы и повреждения. Основное отличие – при апоптозе, которые не происходит случайно, из остатков клеток образуются апоптические тела, которые поедаются вызванными для этого фагоцитами, что препятствует воспалению и отравлению соседних клеток, а при некрозе происходит отмирание клеток и целых тканей, сопровождающееся сильным воспалением.


Интересный факт, что термин «апоптоз» означал опадание лепестков и листьев у растений, что, на мой взгляд, не совсем верно, так как при апоптозе остатки клетки утилизируются собственным организмом, а при опадании листьев они просто отваливаются и уже перерабатываются другими организмами. Хотя оба процесса носят запрограммированный характер. Но это всего лишь философско-лингвистические рассуждения.

Наши клетки – своеобразные ипохондрики и могут покончить с собой по любой причине: перегрев, радиационное облучение, гипоксия и многое другое. В целом клетки на столько склонны к самоубийству, что они все время получают сигнал от других клеток : «Живи-живи-живи» и прерывание этого сигнала сразу приводит к сильной депрессии с последующим намыливанием веревки апоптозу. Забавно, что из таких вот клеток складывается организм с весьма ощутимым инстинктом самосохранения… . Во истину, природа полна парадоксов.

Условно можно выделить три стадии апоптоза: инициация или получение сигнала, эффекторная стадия, в которой запускаются процессы деградации и, собственно, процесс разрушения и деградация – формирование апоптических тел с последующим поеданием макрофагами.

Выделяют 2 пути инициации: митохондриальный и внешний сигнал.

Митохондрии – энергетические станции нашего организма, там собственно и происходит процесс клеточного дыхания с превращением кислорода в воду. В школьных учебниках митохондрии изображались как такие вытянутые овалы разбросанные по всех клетке. Но это не совсем так. Если посмотреть на срез клетки, то вы действительно увидите такую картину, но при трехмерной реконструкции клеток по этим тонким срезам ученые обнаружили, что митохондирия в клетке всего одна, но она имеет сложную изогнутую структуру, поэтому на срезах мы видим различные ее выросты.


Митохондрии окружены двумя клеточными мембранами и между ними находятся белки апоптоза или апоптические белки, которые вырываются на свободу при разрыве внешней мембраны или формировании в ней пор. Собственно это и является ключевой фазой начала апоптоза. Освободившиеся белки через ряд биохимических реакций активируют каспазы — ферменты, которые разрушают другие белки. Каспазы начинаю крушить все вокруг себя, разрушая все основные клеточные структуры. В процессе разрушения митохондриальной мембраны не только высвобождаются белки, но и вода начинает активно поступать в митохондрию, вызывая ее разбухание.

Второй путь начала апоптоза – сигнальный.  На поверхности клеток есть рецепторы клеточной гибели, специальные лиганды, продуцируемые другими клетками (частенько это бывают активированные макрофаги, которые позже и подъедают остатки), связываются с этими лигандами и активируют их. Рецепторы представляют собой большую молекулу, которая сидит в клеточной мембране и выступает с обоих сторон: внутрь клетки и наружу. С наружной стороны садится лиганд и по всему рецептору передается сигнал на внутреннюю сторону. Далее запускается цепь биохимических реакций, в результате которой, как и в митохондриальном пути, активируются каспазы.


На второй стадии апоптоза – эффекторной, уже не так важно как клетка получила сигнал. На этой стадии внутри начинается настоящий апокалипсис и главную роль в нем играют каспазы. Второй важный элемент этой стадии – флавопротеин AIF, который выходит из митохондрий и активируют эндонуклеазы – белки, которые разрушают ДНК клетки. Фактически, после этой стации клетка представляет собой город после ядерной бомбежки.

Во время разрушения митохондриальной мембраны также высвобождается весь энергетический комплекс, который провоцируют образование активных форм кислорода внутри клетки. Свободные радикалы запускают цепные реакции, которые способствуют разрушению содержимого клетки. В этот момент их уже нельзя сдержать антиоксидантами.

После этого начинается третья и последняя стадия – деградация. Клетка теряет свою форму и сжимается из-за разрушения клеточного скелета. Далее начинается фрагментация клетки на мелкие части, которые представляют собой клеточную мембрану с остатками внутри – эти образования получили название – апоптические тела. Вокруг умирающей клетки уже дежурят макрофаги, готовые набросится на останки. В процессе клетки, на поверхности  мембраны появляются сигнальные белки, которые привлекают голодных макрофагов и вот, они уже поглощают останки погибшего сородича.

iv>

Пишу это, а сама думаю, что это все мне напоминает какую-то сцену из популярных ныне зомбо‑апокалипсисов. Прямо страшно стало. Один кровоподтек и на тебя набросятся и сожрут. Бр-р.

Но и у клеток есть антидепрессанты, которые держат эти процессы под контролем не давая среагировать на малейший стресс – это ингибиторы апоптических белков. Но, как только мембрана митохондрий начинает выпускать предшественников апокалипсиса, на волю вырывается и белок SMAC, который деактивируют эти ингибиторы и они становятся бесполезны. После этой стадии апоптоз уже сложно остановить.

Не стоит думать, что апоптоз – исключительно мрачно-негативное явление нашего организма. С помощью апоптоза поддерживается правильное количество и соотношение различных клеток в организме. Апоптоз играет далеко не последнюю роль в нашем развитии: например, разделение пальцев на руках и ногах является следствием запрогроммированной гибели клеток. При прорезании зубов у детей еще до того, как появится зуб начинается процесс гибели клеток десны, чтобы зубу было легко выйти. Хвост у головастиков также не отваливается с появлением ног, а деградирует с помощью того же явления.

Апоптоз незаменим при предотвращении развития раковых опухолей. Во время нашей обычной жизни огромное количество клеток в организме претерпевают патологические изменения и перерождаются в потенциально раковые клетки. Соседние клетки, как и бабушки на скамейки около подъезда, внимательно следят за своими соседями и при неадекватном поведении посылают клетке сигнал апоптоза еще до того, как она размножится и станет опасна. Собственно по этой причине за последние 20 лет сильно возрос интерес к апоптозу, как средству для предотвращения и борьбы со злокачественными опухолями.

Источник: sunely-tales.livejournal.com

Биологическое значение апоптоза


Биологическое значение апоптоза состоит в том, что это ключевой механизм поддержки генетического гомеостаза, который организм использует для удаления клеток, чье выживание нежелательно: чужеродных, дефектных с поломками в геноме; мутантных или зараженных вирусом; с неадекватной специфичностью рецепторов к различным регуляторам жизнедеятельности и т.д.

В организме в каждую единицу времени миллионы клеток завершают свой цикл, отрабатывают «свой век». Для предотвращения «засорения» организма от успевших выполнить свою функцию «отработанных», «изношенных» клеток в ходе эволюции выработался специальный механизм их ликвидации — апоптоз.

Способность запускать самоликвидацию (апоптоз), является неотъемлемым свойством клеток для поддержания тканевого гомеостаза путем сохранения определенного баланса между пролиферацией (митозом) и гибелью.

Апоптоз играет исключительно важную роль в эмбриогенезе, в частности в регуляции количества мезодермальной ткани при формировании органов и скелета. В основе уничтожения иммунными клетками чужеродных также лежит апоптотический механизм.

Гибель клеток по типу апоптоза происходит при многих физиологических процессах: возрастной инволюции органов (тимус), атрофии (предстательной железы после кастрации), регрессии гиперплазии нормапьном функционировании яичников и семенников и, наконец, в уничтожении мутантных клеток.

Механизм активации апоптоза

>

Зрелые дифференцированные клетки в обычном состоянии устойчивы к индукции апоптоза, но становятся чувствительными к нему после своей активации. Такую активацию вызывают различные внешние воздействия через специфические рецепторы и внутриклеточные сигналы, вызванные экспрессией некоторых протоонкогенов.

Они могут быть физиологическими — активация специальных киллерных цитокинов, изменения гормонального статуса (цикличное изменение эндометрия и др.), и нефизиологическими — внутриклеточные повреждения или неблагоприятные условия (нехватка факторов роста, повреждения ДНК, гипоксия и т.д.).

В механизмах активации апоптоза выделяют два основных этапа: фазу индукции (принятия решения) и фазу экзекуции (исполнения приговора). В первую фазу система сенсоров апоптоза отслеживает отклонения от нормы внутри- и внеклеточной среды и определяет дальнейшую судьбу клетки: жить ей или умереть.

Класс сенсоров представляет собой рецепторы клеточной поверхности, которые связывают сигналы выживания или смерти. В качестве таких сигналов выступают различные, цитокины.


При выявлении аномалий (например, повреждение ДНК, нехватка факторов роста, гипоксия и др.) посредством сенсорных регуляторов запускается вторая фаза апоптоза — исполнения приговора. Начинается она с активации каспаз + ферментов семейства цистеиновых протеиназ (так называемые казнящие каспазы).

Существует два принципиально разных пути активации каспаз. Один из них запускается в ответ на активный сигнал смерти, передаваемый специфическими киллерными цитокинами группы ФНО (фактор некроза опухолей) на соответствующие рецепторы (наиболее изучены Fas), называемые рецепторами смерти.

Апоптоз, вызванный активированными рецепторами смерти, называется инструктивным апоптозом. При втором пути активации каспаз ключевую роль играют митохондрии — митохондриальный апоптоз.

При этом различные повреждающие воздействия вызывают увеличение проницаемости мембраны митохондрий и выход в цитоплазму митохондриальны белков (в основном цитохрома С), которые через соответствующий каскад реакций и активируют каспазы.

Ключевую роль в регуляции проницаемости митохондриальной мембраны для цитохрома С играют белки семейства bcl-2, обладающие либо проапоптотическими, либо антиапоптотическими активностями.

Таким образом, в клетках человека в ответ на повреждения существует два механизма, запускающих апоптоз: инструктивный, вызываемый рецепторами смерти, и митохондриальный, обусловленный повышенной проницаемостью мембран. Между ними существует взаиморегуляция, что позволяет надежнее достигать конечного эффекта.


В итоге активированные тем или иным путем каспазы протеолитически расщепляют ключевые структурные компоненты клетки, что приводит к фрагментации ДНК и деструкции клетки. При этом цитоппазматический и ядерный скелеты разрушаются, хромосомы деградируют, ядро фрагментируется, но без разрыва клеточной мембраны.

Поэтому такая клетка может быть утилизирована фагоцитами и соседними клетками, и даже массовая их гибель не приводит к каким-либо патологическим процессам. Процесс протеолиза продолжается 30-120 минут, затем сморщенная клетка поглощается макрофагами и исчезает обычно в течение 24 часов (рис. 3.13).

obchon_r3.13.jpg
Рис. 3.13. Фагоцитоз апоптотической клетки макрофагом [Фильченков А.А., Стойка Р.С., 1999]. 1 — фрагментированное ядро; 2 — фрагменты цитоплазмы (апоптотические тельца): 3 — фрагменты апоптотической клетки захвачены макрофагом.

Задачей апоптоза является утилизация фрагментов клетки пока ее содержимое не попало во внеклеточную среду и не вызвало воспалительного процесса. Внешние морфологические проявления апоптотической гибели клеток в виде кариопикноза (сморщивание ядра), кариорексиса (распад ядра на части), конденсации (сжатия) клетки и др. были известны давно и только в последнее время показано, что это частные проявления апоптоза. Вокруг клеток, подвергшихся апоптозу, воспалительный процесс не возникает.


Гибель клеток по типу апоптоза следует отличать от некроза — другой формы гибели клеток организма. Некроз инициируется нефизиологическими агентами, а апоптоз — и физиологическими, и нефизиологическими. В отличие от некроза, апоптоз встречается не только в патологически измененных, но и нормальных тканях.

Некроз происходит в случае, когда клетки подвергаются действию экстремальных факторов и поэтому его можно назвать патологической гибелью. При некрозе морфологические изменения как реакция на летальное повреждение клетки, почти всегда начинается с повреждения плазматической мембраны, что не бывает при апоптозе.

Из-за разрыва мембраны в клетку из внеклеточного пространства поступают молекулы воды и ионов и вызывают набухание структур. Одновременно попадание содержимого цитоплазмы (в том числе лизосомальных ферментов) во внеклеточное пространство вызывает повреждения тканей и развитие выраженного воспалительного процесса, что не происходит при апоптозе.

Кроме того, при апоптозе отмирают одиночные клетки, а при некрозе — их группы. Уничтожение клеток путем апоптоза по сравнению с некрозом обеспечивает минимальное повреждение тканей. Между этими процессами имеются и другие различия. На рисунке 3.14 схематически представлены две формы гибели клеток.

obchon_r3.14.jpg
Рис. 3.14. Схематическое представление о двух формах гибели клеток [по Wyllle А. и соавт., 1998].


Как и другие физиологические процессы, апоптоз регулируется большим числом генов. Ключевая роль в запуске программы апоптоза принадлежит гену-cупpeccopy р53. Вследствие особой значимости р53 был назван геном XX века. р53 поддерживает стабильность генетического аппарата и осуществляет контроль над клеточным циклом.

В норме, при повреждениях структуры ДНК или других формах генотоксического стресса отмечается быстрая активация р53. Его белок блокирует клеточный цикл в фазе G1 до удвоения ДНК и митоза, инициирует и участвует в процессах репарации ДНК. Это позволяет клетке восстанавливать поврежденный участок ДНК, что предотвращает появление мутантных клеток.

При тяжелых неустранимых повреждениях р53 запускает программу апоптоза и тем самым предупреждает патологическую пролиферацию. Важно подчеркнуть, что р53-зависимый апоптоз элиминирует из организма не только поврежденные, но и те клетки, в которых наблюдается нерегулируемая стимуляция пролиферации.

Если р53 мутирует, он инактивируется и перестает запускать апоптозный каскад, что дает возможность сохраняться клеткам с поврежденной ДНК во время митоза, а это в свою очередь приводит к выживанию клеток, подвергшихся опухолевой трансформации (рис 3.15).

obchon_r3.15.jpg
Рис. 3.15. Регулирующее влияние антионкогена р53 [Kirby K.S.; цит по Моисеенко В.М. и соавт. 2004]. Повреждение гена создает условия для патологической клеточной пролиферации.

Предполагается, что увеличение частоты неоплазии с возрастом связано не с накоплением мутаций в геноме клеток, а с возрастными нарушениями системы репарации ДНК.

Естественно, апоптоз рассматривается как мощная противоопухолевая защита. Угнетение процесса резко облегчает превращение нормальной клетки в раковую, так как в неспособных к апоптозу клетках легко будут накапливаться различные мутации.

Такие клетки-мутанты, несмотря на повреждения ДНК, будут продолжать активно размножаться. Накопление критического количества мутаций неизбежно приведет к появлению неоппастической клетки и формированию злокачественной опухоли (рис. 3.16).

obchon_r3.16.jpg
Рис. 3.16. Нарушение процессов пролиферации (П) и апоптоза (А) клеток при онкогенезе [Фильченков А.А., Стойка Р.С., 1999].

Приобретенная резистентность к апоптозу является признаком большинства, если не всех опухолевых клонов. Уход от апоптоза резко повышает жизнеспособность неопластической клетки, делает ее менее чувствительной к факторам противоопухолевого иммунитета и терапевтическим воздействиям. Опухолевые клетки приобретают резистентность к апоптозу различными путями.

На сегодня установлено, что к ослаблению индукции апоптоза могут привести потеря экспрессии на поверхности клетки рецептора смерти Fas; нарушения проведения апоптогенного сигнала к митохондриям и ингибирование проницаемости митохондриальной мембраны для цитохрома С; блокирование активации и/или резкое уменьшение времени жизни казнящих каспаз.

Очевидно, наряду с белками, включающими апоптоз, есть белки, препятствующие ему, и между теми и другими существует тонкий баланс. Гены, способствующие апоптозу, относятся к генам-супрессорам (кроме р53, ВАХ, PML и др.). Гены, блокирующие работу этого защитного механизма — к протоонкогенам (BCL1, BCL2 и др.).

Последние при их активации нейтрализуют апоптозную активность и будут резко увеличивать появление постоянно пролиферирующих мутантных клеточных клонов, а, следовательно, и вероятность последующего развития из них злокачественных опухолей.

Считается, что соотношение количества различных форм онкобелков группы BCL и р53 определяет реостат жизни и смерти клетки. В связи с этим следует заметить, что вследствие существования механизма апоптоза принципиально невозможно достигнуть бессмертия организма.

С течением времени наступает атрофия клеток органов, регуляторов жизнедеятельности организма и развивается ряд заболеваний, которые объединяют общим названием — старость.

Угляница К.Н., Луд Н.Г., Угляница Н.К.

Источник: medbe.ru

Апоптоз в регуляции клеточного равновесия и формировании опухолевого роста

Е.Б. Владимирская

НИИ детской гематологии Министерства здравоохранения РФ, Москва

Ключевые слова: кроветворение, лейкозы, опухоли, апоптоз, химиотерапия  

Apoptosis in regulation of cellular balance and formation of tumour growth 

E.B.Vladimirskaya  

Research Institute of Paediatric Haematology, Ministry of Public Health of the Russian Federation, Moscow

Key words: haemopoiesis, leukaemias, tumours, apoptosis, chemotherapy


 

Для корреспонденции: Владимирская Елена Борисовна, доктор медицинских наук, профессор, руководитель отдела молекулярной гематологии НИИ детской гематологии
Адрес: 117513, Москва, Ленинский проспект, 117
Телефон: (095) 935-2577
E-mail: [email protected]

Статья поступила 01.11.2002 г., принята к печати 12.01.2003 г.


 

Клеточная продукция нормального кроветворения велика. Многочисленные расчеты показывают, что у мужчины с массой тела 70 кг в сутки образуется 1 × 1011 лейкоцитов и 2 × 1011 эритроцитов, что составляет клеточную массу соответственно 100 и 200 г (в сумме 300 г). Таким образом, в организме взрослого мужчины в месяц образуется 9 кг клеток крови, в год – около 100 кг, а за 70 лет жизни – порядка 7 т клеток. Клеточное равновесие в столь продуктивной клеточной системе, каковой является нормальное кроветворение, поддерживается основным законом клеточной кинетики: в единицу времени рождается и умирает одно и то же количество клеток.

Закономерности рождения клеток крови, т.е. клеточной пролиферации, ее механизмы на клеточном, биохимическом, молекулярно-генетическом уровнях, регуляция этих процессов хорошо изучены и нашли свое окончательное концептуальное оформление в молекулярно-биологических исследованиях последних 15 лет. Однако в последнее десятилетие биологам стало ясно, что механизм и регуляция клеточной смерти – процессы столь же сложные, но значительно менее изученные. Оказалось, что все клетки многоклеточного организма и некоторые одноклеточные несут в себе генетически детерминированную программу самоубийства. При активации ее наступает клеточная смерть характерной формы, называемая апоптозом. Термин «апоптоз» для обозначения «запрограммированной клеточной смерти» предложил J.F.Kerr в 1972 г. (от греч. apo – полное, ptosis – падение, утрата), заимствовав его у Гиппократа, назвавшего так «осенний листопад».

Апоптоз может быть включен множеством внутренних и внешних сигналов и направлен на освобождение от старых или наработанных в избытке клеток, а также от клеток с нарушениями дифференцировки и повреждением генетического вещества, в том числе и при вирусном заражении. Морфологические признаки апоптоза хорошо известны, являются следствием контролируемого самопериваривания, представлены сморщиванием клетки, конденсацией и фрагментацией ядра, разрушением цитоскелета и буллезным выпячиванием клеточной мембраны (рис. 1). Особенностью апоптоза является то, что умирающая клетка сохраняет целостность своей мембраны до полного завершения процесса и только тогда разрушение ее оболочки является сигналом для расположенных вблизи фагоцитов к поглощению оставшихся фрагментов и завершению процесса клеточной деградации. Апоптотические клетки, не подвергшиеся немедленному фагоцитозу, превращаются в мелкие, связанные с мембраной фрагменты, называемые апоптотическими телами. Важной чертой апоптоза является то, что удаление умирающих клеток происходит без развития воспаления. В отличие от апоптоза, некроз представляет собой патологическую форму смерти клеток в результате их острого повреждения, разрыва оболочки, высвобождения содержимого цитоплазмы и индукции воспалительного процесса. Основные различия между процессами апоптоза и некроза суммированы в табл. 1.

Количество работ, посвященных апоптозу, растет в последние годы с лавинообразной быстротой, исчисляется тысячами, что свидетельствует о фундаментальном биологическом значении этого процесса. Попробуем суммировать основные сведения о механизмах апоптоза.

Механизмы апоптотической смерти клеток

Пути реализации программы апоптоза разнообразны, зависят как от индивидуальных особенностей клеток, так и от характера и степени выраженности внешних и внутренних воздействий, вызывающих ее включение.

рис.1 Морфология апоптоза при электронной микроскопииМногое в механизмах осуществления апоптоза остается неясным, сигнальные пути передачи апоптотического сигнала переплетаются с сигнальными путями других программ жизнедеятельности клеток, создавая сложную картину внутри- и межклеточных взаимодействий, лежащих в основе регуляции и саморегуляции клеточного роста и дифференцировки.

Однако некоторые механизмы апоптоза достаточно изучены, их обсуждение существенно для понимания многих вопросов регуляции кроветворения и иммуногенеза человека.

Процесс апоптоза может быть разделен на 2 фазы:

• формирование и проведение апоптотических сигналов – фаза принятия решения;

• «демонтаж» клеточных структур – эффекторная фаза.

Рассмотрение цепочки апоптотических событий удобнее начать с завершающей стадии апоптоза.таблица1 Основные различия между видами клеточной смерти

Основными фигурантами эффекторной фазы апоптоза являются цистеиновые протеазы (каспазы). Каспазы расщепляют белки, являющиеся мишенями для их действия, характерным для апоптоза образом – в местах расположения аспарагиновых оснований. К настоящему времени у человека идентифицировано 14 видов каспаз, которые по своим функциональным особенностям могут быть разделены на 3 группы:

• активаторы цитокинов (каспазы-1, 4, 5, 13);

• каспазы-индукторы активации эффекторных каспаз (каспазы-2, 8, 9, 10);

• эффекторные каспазы-исполнители апоптоза (каспазы-3, 6, 7).

Каспазы находятся в клетках в неактивном состоянии (прокаспазы). Активация каспаз происходит путем их протеолитического расщепления в местах расположения аспарагиновых оснований с последующей димеризацией образованных таким образом активных субъединиц.

Эффекторные каспазы, будучи активированными, начинают цепь протеолитических событий, целью которых является апоптотический «демонтаж» клетки.

К ингибиторам эффекторных каспаз относятся белки семьи IAP, подавляющие активность каспаз-3 и 9. Интересно, что один из этих белков – Survin – обнаружен в клетках большинства злокачественных опухолей. С ним связывают резистент- ность опухолевых клеток к химиотерапии.

Исходя из ведущей роли каспаз в осуществлении клеточной смерти этого типа, апоптоз, с биохимической точки зрения, можно рассматривать как клеточную смерть, индуцированную каспазами.

Справедливости ради следует отметить, что каспазы, являясь основными эффекторами апоптоза, все же до конца не монополизируют эту клеточную активность. В ряде клеточных систем апоптоз может происходить и при инактивации каспаз, за счет активности других эффекторов, таких как активированные кальцием протеазы (например, кальпейн при индуцированном апоптозе лейкемических клеток), сериновые и лизосомальные протеазы, эндонуклеазы. Однако значение этих эффекторов в реализации апоптоза невелико и носит чаще всего дополнительный, компенсаторный характер.

Основная задача системы, регулирующей апоптоз, – держать эффекторные каспазы, демонтирующие клетки, в неактивном состоянии, но быстро переводить их в активную форму в ответ на минимальное действие соответствующих индукторов.

Функцию активации эффекторных каспаз берут на себя каспазы-индукторы, основными представителями которых являются каспаза-8 и каспаза-9.

Эти каспазы при обычном состоянии клетки неактивны, существуют в форме прокаспаз. Отсюда действие разнообразных проапоптотических сигналов направлено на активацию каспазы-8 и каспазы-9. В соответствии с этим выделяют 2 типа ведущих сигнальных путей:

1) повреждение ДНК, радиация, действие токсических агентов, действие глюкокортикоидов, прекращение цитокиновой регуляции, укорочение до критического уровня теломеров – активация каспазы-9;

2) проапоптотические сигналы, возникающие при активации рецепторов «региона клеточной смерти» (например, FasR, TNFR) – активация каспазы-8.

Повреждение ДНК вызывает активацию гена р53. Дальнейшее прохождение апоптотического сигнала этого типа происходит через активацию проапоптотических генов семьи Bcl-2 (Bax и Bid). Белки этих генов вызывают пермеабилизацию мембраны митохондрий и выход в цитозоль цитохрома C, аденозинтрифосфорной кислоты (dATP), апоптозиндуцирующего фактора (Aif) и ДНКазы. Цитохром C вместе с dATP активирует находящийся в цитозоле белок Apaf-1, образуя апоптосому, в которой происходит активация каспазы-9. Последняя активирует каспазу-3 – основной «экзекьютор» каспазного каскада. Вслед за этим активируются другие каспазы, протеазы и ДНКазы, происходит апоптоз. Высвобожденные из митохондрий Aif и ДНКаза выполняют дополнительный внекаспазный путь апоптоза, реализуют свою активность непосредственно в ядре.рис.2 Основные пути апоптоза. Объяснение в тексте

Связывание рецепторов «региона клеточной смерти» с соответствующими лигандами приводит к активации каспазы-8, способной к независимой активации каспазы-3. На этом пути может происходить и дополнительное вовлечение генов семьи Bcl-2 путем активации каспазой-8 белков гена Bid.

Модель апоптоза

Многое в регуляции апоптоза и в путях его реализации остается неясным.

При наличии столь сложных и консервативных путей генетической регуляции апоптоза он может происходить в клетках, лишенных ядра, в условиях ареста белкового синтеза, а также и в изолированных ядрах, находящихся вне клеток. Клетки могут подвергаться апоптозу в любой стадии клеточного цикла, при этом чувствительность их к апоптотическим стимулам различна.

Эти данные заставляют предположить, что отдельные компартменты клетки автономны в отношении апоптоза, а эффекторы его конституционально экспрессированы в каждой клетке, при этом контроль за их активностью может осуществляться с помощью как внутри-, так и внеклеточных сигналов.

Все это привело к созданию модели апоптоза, по которой каждая клетка при своем рождении как бы запрограммирована на самоуничтожение, условием жизни ее является блокирование этой суицидальной программы, осуществляемое постоянно или с небольшими интервалами.

К наиболее серьезным физиологическим ингибиторам апоптоза относятся ростовые факторы, экстрацеллюлярный матрикс, CD40-лиганд, нейтральные аминокислоты, цинк, эстрогены, андрогены. Механизм их действия неясен, его возможными путями могут быть снижение концентрации эффекторов апоптоза или снижение их активности до безвредного уровня, активация антиапоптотических факторов (например, гена Bcl-2). С этих позиций становится понятным особое значение связей клеток с экстрацеллюлярным матриксом, столь важное для функционирования нормального кроветворения.

Дифференцировка в нормальном кроветворении является стохастическим процессом, т.е. стволовые кроветворные клетки и клетки-предшественники осуществляют заложенную в их геном дифференцировочную программу автоматически при единственном условии – выживании, для чего необходимо воздействие на них антиапоптотических факторов. Самыми мощными антиапоптотическими стимулами для нормального кроветворения являются ростовые факторы. Ростовые факторы, наиболее активно участвующие в апоптозе клеток крови, их основные мишени и характер воздействия приведены в табл. 2.

Как следует из данных, представленных в табл. 2, большинство ростовых факторов, участвующих в кроветворении, препятствует апоптозу. При этом диапазон их действия широк, не ограничивается только клетками-предшественниками и пролиферирующими костно-мозговыми элементами, но простирается и на зрелые элементы, своим антиапоптотическим воздействием обеспечивая их выживание и нормальное функционирование (например, GM-CSF- и G-CSF-факторы, необходимые  для фагоцитоза нейтрофилов). Однако некоторые ростовые факторы оказывают амбивалентное действие в зависимости от воспринимающих их клеток-мишеней.Таблица 2 Ростовые факторы, вовлеченные в апоптоз

Действие большинства ростовых факторов происходит через специфические рецепторы или FasR и реализуется через семью Bcl-2 генов, индукция апоптоза может также происходить путем увеличения эндогенного уровня глюкокортикоидов – мощного проапоптотического фактора.

Регуляция апоптоза на генетическом уровне осуществляется в значительной мере посредством теломер-теламеразной активности клеток.

Теломерами называют концевые участки хромосом, состоящие из сотен повторяющихся, строго определенных нуклеотидных последовательностей (рис. 3). Эти последовательности, напоминающие «шапочки», надетые на концы хромо- сом, выполняют важную функцию в сохранении стабильности хромосом, предохраняя их от слияний, транслокаций и других поломок в процессе митоза. Из-за существования так называемых проблем концевой репликации ДНК, выражающихся в невозможности полного восстановления длины теломера при каждом ресинтезе ДНК, происходит его последовательное укорочение в процессе деления соматических клеток. Достижение теломером минимальной длины, способной защитить хромосомы от повреждения (2–5 kb), является сигналом для выхода клеток из митотического цикла с последующим включением апоптоза по первому сигнальному пути. Обычно для соматических клеток для этого требуется 60–80 удвоений. Исходя из этого, теломеры принято считать «биологическими часами» клетки, играющими ведущую роль в процессах старения.рис.3 Теломер. TTAGGG - концевые нуклеотидные повторы, составляющие теломер (тимин, аргинин, гуанин)

В табл. 3 приведены данные о средней длине теломеров кроветворных клеток различных иерархических уровней.

Таблица3 Длина теломеров kb в различных кроветворных клетокИз представленных данных следует, что наиболее длинные теломеры были выявлены в клетках тканей плода и новорожденных. В мононуклеарных и CD34+ -клетках периферической крови и костного мозга взрослых теломеры оказались значительно короче. В последние годы было показано, что укорочение теломеров в детском возрасте происходит значительно скорее чем у взрослых. Такие представления и дали основание считать теломеры «биологическими часами» клеток. Предполагается, что укорочение теломера является механизмом, определяющим число клеточных делений, предшествующих старению.

Противостоит этим событиям теломераза – рибонуклеопротеиновый энзим, который используется в качестве матрицы для синтеза TTAGGG последовательностей в концевых участках хромосом, препятствуя таким образом укорочению теломеров.

Теломераза – нормальный компонент зародышевых и самообновляющихся тканей, но в большинстве соматических клеток отсутствует или присутствует в редуцированном количестве, зато ее содержание оказывается высоким в большинстве опухолевых клеток.

Снижение или повышение способности клеток к апоптозу приводит к нарушению гомеостаза и может лежать в основе развития разнообразной патологии.рис.4 Нарушение клеточного равновесия при изменении уровня апоптоза.

Исследования последних лет показали, что патогенез многих болезней человека, в том числе рака, лейкозов, аутоиммунных болезней и вирусных инфекций, связан с неспособностью клеток подвергаться апоптозу. Другие болезни, такие как нейродегенеративные расстройства, СПИД, остеопороз, апластическая анемия и др. могут быть связаны, напротив, с повышенной способностью клеток к апоптозу. Графически влияние изменения скорости апоптоза на состояние клеточного равновесия представлено на рис. 4. Перечень заболеваний, связанных с торможением или индукцией апоптоза, приведен в табл. 4.Таблица 4 Болезни, связанные с торможением и усилением апоптоза

 

Роль апоптоза в развитии опухолевого роста

Снижение способности к апоптозу играет существенную роль в развитии многих опухолей, осуществляется это с помощью различных механизмов, анализ которых может быть полезен для понимания существующих и поиска новых путей подавления опухолевого роста.

Наиболее хорошо изученным механизмом подавления апоптоза, лежащего в основе наработки опухолевого клона, является аутокринное и паракринное повышение экспрессии к ним ростовых факторов и рецепторов, возникающее в опухолевых клетках вследствие активации онкогенов. Именно это свойство делает клетки опухолевого клона независимыми от микроокружения и лежит в основе их метастазирования.рис.5 Иммунная атака опухолевых клеток

Кроме того, мутация онкогена нередко сопровождается извращением его функции. Типичным примером такого механизма наработки опухолевого клона является хронический миелолейкоз, при котором транслокация t(9;22), известная под названием филадельфийской хромосомы, приводит к образованию химерного гена Bcr/Abl, продуктом которого является онкобелок, обладающий повышенной тирозинкиназной активностью и служащий важным звеном в передаче антиапоптотических сигналов в клетке. Механизм антиапоптотической активности этого онкопротеина расшифрован совсем недавно. В норме онкопротеин, кодируемый геном c-abl, участвует в реализации программы апоптоза во многих клеточных системах. Онкопротеин р210, кодируемый химерным геном Bcr/Abl при хроническом миелолейкозе, и онкопротеин р185, секретирующийся тем же химерным геном при остром лимфобластном лейкозе, обладают противоположной, антиапоптотической активностью – предохраняют клетки от облучения, цитотоксических препаратов и проапоптотических сигналов, возникающих при связывании Fas-рецептора. Осуществляется это путем блокирования Bax-гена и задержки выхода цитохрома С из митохондрий.

Другой пример – мутация онкогена c-myc. В норме экспрессия онкогена c-myc выражается в усилении пролиферации и в то же время способствует аресту клетки и апоптозу при прекращении действия на нее ростовых факторов. Такой физиологический механизм направлен на ограничение накопления пролиферирующих клеток. На модели мышиной лимфомы и опухолево-трансформированной линии фибробластов показано, что мутация c-myc в опухолевых клетках сопровождается разобщением этих функций, при этом c-myc-онкобелок отключает апоптоз в поврежденных пролиферирующих клетках, активируя ген Bcl-2, либо препятствуя активации Apaf-комплекса.

Другим механизмом поломки апоптоза в опухолевых клетках является мутация в генах, контролирующих суицидальную программу. В ряду этих процессов находится хорошо изученная оверэкспрессия гена Bcl-2, тормозящего апоптоз, что лежит в основе развития не только В-клеточной фолликулярной лимфомы человека, но и многих других опухолей.

Онкогенная трансформация клетки часто сопровождается мутацией в гене p53 и превращением его из индуктора в ингибитор апоптоза, что является во многих случаях ключевым механизмом в наработке опухолевого клона. Именно этот ген должен явиться сенсором множества сигналов, возникающих при наработке опухолевого клона и призванных включить апоптоз. К ним относятся: снижение поступления ростовых факторов; потеря межклеточных взаимодействий и связей с микроокружением; гипоксия вследствие недостаточного кровоснабжения; повреждение ДНК в результате мутаций и воздействия токсинов; укорочение теломера вследствие митогенного стресса и др. Все эти факторы должны включать апоптоз через посредство гене p53, как это было показано ранее. При снижении его активности или в результате патологической мутации этого не происходит, что лежит в основе накопления опухолевых клеток и дальнейшей опухолевой прогрессии. Мутация в гене p53 является также одним из факторов метастазирования опухоли, так как разрешает опухолевым клеткам длительно пребывать в суспензии без поддержки специфического микроокружения, что в норме должно было бы завершиться апоптозом.

Малоизученным, но не менее важным, как в понимании онкогенеза, так и в поисках новых путей коррекции его, является торможение апоптоза в результате нарушений его эффекторных механизмов и путей передачи проапоптотических сигналов. В этом отношении особый интерес представляет острый промиелоцитарный лейкоз (ОПЛ). Как показали исследования последних лет, в основе развития этой опухоли лежит транслокация t(15;17), в результате которой происходит слияние Pml-гена (хромосома 15) с рецептором гена ретиноевой кислоты (хромосома 17). Белок, являющийся продуктом Pml-гена, в норме модулирует как каспаззависимые, так и каспазнезависимые пути апоптоза, и потому его можно считать одной из центральных фигур апоптотического каскада. Необходимым условием осуществления проапоптотической функции Pml-белка является локализация его в специфических «крапчатых» ядерных структурах, по- лучивших название «ядерные тельца» (NB). При ОПЛ в результате транслокации t(15;17) происходят следующие события, приводящие к образованию опухолевого клона, резистентного к стандартной химиотерапии:

• выход Pml-белка из региона NB и потеря его проапоптотической функции;

• блокада синтеза ретиноевой кислоты, необходимой для дифференцировки клеток, в результате связывания химерным продуктом путей передачи транскрипционного сигнала гена ретиноевой кислоты.

Таким образом, особенностью патогенеза ОПЛ является сочетание торможения дифференцировки с блокированием апоптоза в клетках опухолевого клона. Значение ретиноевой кислоты и триокиси мышьяка в индукции ремиссии при ОПЛ связано с тем, что первый препарат вызывает клеточную дифференцировку, а второй – апоптоз, восстанавливая нормальную локализацию Pml-белка в NB.

Одним из ключевых моментов развития опухолевого процесса является ослабление противоопухолевого иммунного надзора. Известно, что в этих процессах активное участие принимают сами опухолевые клетки, секретируя растворимые иммуносупрессивные факторы и снижая иммуногенную активность экспрессированных на своей поверхности молекул главного комплекса гистосовместимости. Однако исследования последних лет выявили альтернативный механизм подавления опухолевыми клетками иммунного надзора, оказавшийся связанным с апоптозом.

Fas, также называемый CD95 или APO-1, является членом семьи рецепторов к TNF и широко распространен среди клеток разных видов, в том числе Т- и В-лифоцитов и некоторых опухолевых клеток. Связывание рецептора Fas с Fasлигандом (FasL) индуцирует апоптоз в экспрессирующих его клетках. FasL выделяется цитотоксическими Т-лимфоцита- ми и NK-клетками и является «фактором смерти», индуциру- ющим апоптоз в клетках-мишенях. Экспрессия FasL на клетках некоторых территорий (например, строме глаза или сертолиевых клетках яичек) немедленно убивает попавшие туда активированные клетки воспаления, обеспечивая тем самым запрет иммунных реакций на этих территориях. Эти данные побудили поиск экспрессии FasL на опухолевых клетках. Такой поиск увенчался успехом – FasL был выявлен в сыворотке больных с лейкозами и лимфомой, а также на клетках некоторых солидных опухолей. Лиганды Fas оказались функционально активны, так как были способны убивать клетки-мишени, экспрессирующие Fas-рецептор, при совместном культивировании. Эти данные явились основанием для создания гипотезы, по которой опухолевые клетки могут отражать иммунную атаку, убивая цитотоксические Т-лимфоциты и NK-клетки. При этом экспрессия Fas на опухолевых клетках часто бывает снижена и/или нарушен механизм реализации поступающих с этого рецептора проапоптотических сигналов. При экспрессии FasL на опухолевых клетках его растворимая форма может попадать в циркуляцию, провоцируя клетки, имеющие на своей поверхности Fas-рецептор, к апоптозу и тем самым вызывая мультиорганные поражения, часто наблюдаемые у онкологических больных. Схематично иммунная атака опухолевых клеток представлена на рис. 5.

Высокая активность теломеразы в опухолевых клетках также находится в ряду антиапоптотических факторов, лежащих в основе развития опухолевого роста. Особенное значение этот механизм имеет в патогенезе и патодинамике гемобластозов. Опухоли, исходящие из кроветворных клеток, характеризует сочетание высокой теломеразной активности при малом размере теломеров. Это приводит к продолжению деления опухолевых клеток и после укорочения теломеров ниже критических размеров, что, возможно, объясняет высокую генетическую нестабильность этих опухолей и большую предрасположенность к опухолевой прогрессии.

Апоптоз и противоопухолевая терапия

Исследования последних лет показали, что противоопухолевые препараты вызывают апоптоз, т.е. индуцируют самоубийство опухолевых клеток, используя те же пути, что и физиологические индукторы апоптоза: стимуляция гена p53, модуляция генов семьи Bcl-2, включение Fas-рецептора, активация эффекторных протеаз и эндонуклеаз, блокирование рецепторов антиапоптотических ростовых факторов и стимуляция проапоптотических. При этом многие опухоли сохраняют способность к апоптозу в ответ на те же стимулы, что и их нормальные аналоги. Этим объясняются успех антиандрогеновой терапии при раке предстательной железы и частая регрессия опухоли молочной железы при лечении антагонистами эстрогеновых рецепторов. Цитокины могут оказывать проапоптотическое действие и путем повышения уровня эндогенных глюкокортикоидов. При этом большие дозы препаратов (например, высокие дозы метотрексата) вызывают разрушение клеток путем некроза, что является значительно более токсичным для больного.

Хотя вид клеточной смерти зависит от концентрации препарата, в большей степени выбор остается за клетками. Иными словами, химиопрепараты вызывают апоптоз в клетках, готовых к нему.

Способность к спонтанному апоптозу лейкемических клеток ex vivo коррелирует с их лекарственной чувствительностью. Более того, получены убедительные данные, доказывающие, что наиболее благоприятное течение гипердиплоидных случаев острого лимфобластного лейкоза у детей (с числом хромосом более 51) связано с повышенной способностью этих клеток к спонтанному апоптозу и нечувствительностью к антиапоптотическому действию цитокинов в пробах ex vivo.

Для объяснения механизмов включения апоптоза химиопрепаратами можно воспользоваться гипотезой, по которой дефект, вызываемый ими в опухолевых клетках, считывается как инструкция к запуску апоптоза. В соответствии с этой гипотезой клеточная смерть, индуцированная химиопрепаратами, проходит 3 фазы (рис. 6):рис.6 Схема проапоптотического действия химиотерапии

1. Повреждение. В этой фазе каждый препарат, действуя на свои мишени (ДНК, РНК, микроканальцы и др.), вызывает их повреждение или дисфункцию.

2. Прохождение сигнала. В этой стадии клетка расшифровывает и оценивает полученное повреждение. Например, повреждение ДНК включает ген p53, следствием чего, как рассматривалось выше, является остановка клетки при прохождении митотического цикла и при невозможности репарации – апоптоз. Некоторые препараты, например доксорубицин, могут действовать в обход гена p53, вызывая апоптоз путем активации Fas-рецептора.

3. Индукция апоптоза. В этой фазе принимается окончательное решение и запускаются механизмы апоптоза в тех случаях, когда репарация невозможна. Нормальные клетки чаще принимают решение выйти из митотического цикла для дальнейшей репарации или дифференцировки. Такое решение раковые клетки принимают редко, значительно чаще выбирая в качестве альтернативы апоптоз.

Необходимо отметить высокую готовность к апоптозу кроветворной ткани и опухолей, исходящих из нее, что скорее всего объясняет лучшую эффективность химиотерапии при гемобластозах по сравнению с таковой при солидных опухолях. Способность клеток-предшественников кроветворной ткани человека к апоптозу находится в обратной зависимости от возраста, чем, вероятно, частично можно объяснить лучшую курабельность острых лейкозов у детей, чем у взрослых.

Несмотря на существенное улучшение результатов химиотерапии в онкологии, достигнутое в последние годы за счет повышения ее интенсивости и отработки методов сопроводительной терапии, в определенном проценте случаев развивается резистентность опухолевых клеток к химиопрепаратам, наиболее часто связанная с нарушением в них механизмов апоптоза. Это препятствует полной эрадикации опухоли и обрекает лечение на неудачу. Дальнейшее улучшение результатов химиотерапии в онкологии связано в значительной мере с преодолением этого препятствия.

Источник: ctvm.kz

Апоптоз в регуляции клеточного равновесия и формировании опухолевого роста

Е.Б. Владимирская

НИИ детской гематологии Министерства здравоохранения РФ, Москва

Ключевые слова: кроветворение, лейкозы, опухоли, апоптоз, химиотерапия  

Apoptosis in regulation of cellular balance and formation of tumour growth 

E.B.Vladimirskaya  

Research Institute of Paediatric Haematology, Ministry of Public Health of the Russian Federation, Moscow

Key words: haemopoiesis, leukaemias, tumours, apoptosis, chemotherapy


 

Для корреспонденции: Владимирская Елена Борисовна, доктор медицинских наук, профессор, руководитель отдела молекулярной гематологии НИИ детской гематологии
Адрес: 117513, Москва, Ленинский проспект, 117
Телефон: (095) 935-2577
E-mail: [email protected]

Статья поступила 01.11.2002 г., принята к печати 12.01.2003 г.


 

Клеточная продукция нормального кроветворения велика. Многочисленные расчеты показывают, что у мужчины с массой тела 70 кг в сутки образуется 1 × 1011 лейкоцитов и 2 × 1011 эритроцитов, что составляет клеточную массу соответственно 100 и 200 г (в сумме 300 г). Таким образом, в организме взрослого мужчины в месяц образуется 9 кг клеток крови, в год – около 100 кг, а за 70 лет жизни – порядка 7 т клеток. Клеточное равновесие в столь продуктивной клеточной системе, каковой является нормальное кроветворение, поддерживается основным законом клеточной кинетики: в единицу времени рождается и умирает одно и то же количество клеток.

Закономерности рождения клеток крови, т.е. клеточной пролиферации, ее механизмы на клеточном, биохимическом, молекулярно-генетическом уровнях, регуляция этих процессов хорошо изучены и нашли свое окончательное концептуальное оформление в молекулярно-биологических исследованиях последних 15 лет. Однако в последнее десятилетие биологам стало ясно, что механизм и регуляция клеточной смерти – процессы столь же сложные, но значительно менее изученные. Оказалось, что все клетки многоклеточного организма и некоторые одноклеточные несут в себе генетически детерминированную программу самоубийства. При активации ее наступает клеточная смерть характерной формы, называемая апоптозом. Термин «апоптоз» для обозначения «запрограммированной клеточной смерти» предложил J.F.Kerr в 1972 г. (от греч. apo – полное, ptosis – падение, утрата), заимствовав его у Гиппократа, назвавшего так «осенний листопад».

Апоптоз может быть включен множеством внутренних и внешних сигналов и направлен на освобождение от старых или наработанных в избытке клеток, а также от клеток с нарушениями дифференцировки и повреждением генетического вещества, в том числе и при вирусном заражении. Морфологические признаки апоптоза хорошо известны, являются следствием контролируемого самопериваривания, представлены сморщиванием клетки, конденсацией и фрагментацией ядра, разрушением цитоскелета и буллезным выпячиванием клеточной мембраны (рис. 1). Особенностью апоптоза является то, что умирающая клетка сохраняет целостность своей мембраны до полного завершения процесса и только тогда разрушение ее оболочки является сигналом для расположенных вблизи фагоцитов к поглощению оставшихся фрагментов и завершению процесса клеточной деградации. Апоптотические клетки, не подвергшиеся немедленному фагоцитозу, превращаются в мелкие, связанные с мембраной фрагменты, называемые апоптотическими телами. Важной чертой апоптоза является то, что удаление умирающих клеток происходит без развития воспаления. В отличие от апоптоза, некроз представляет собой патологическую форму смерти клеток в результате их острого повреждения, разрыва оболочки, высвобождения содержимого цитоплазмы и индукции воспалительного процесса. Основные различия между процессами апоптоза и некроза суммированы в табл. 1.

Количество работ, посвященных апоптозу, растет в последние годы с лавинообразной быстротой, исчисляется тысячами, что свидетельствует о фундаментальном биологическом значении этого процесса. Попробуем суммировать основные сведения о механизмах апоптоза.

Механизмы апоптотической смерти клеток

Пути реализации программы апоптоза разнообразны, зависят как от индивидуальных особенностей клеток, так и от характера и степени выраженности внешних и внутренних воздействий, вызывающих ее включение.

рис.1 Морфология апоптоза при электронной микроскопииМногое в механизмах осуществления апоптоза остается неясным, сигнальные пути передачи апоптотического сигнала переплетаются с сигнальными путями других программ жизнедеятельности клеток, создавая сложную картину внутри- и межклеточных взаимодействий, лежащих в основе регуляции и саморегуляции клеточного роста и дифференцировки.

Однако некоторые механизмы апоптоза достаточно изучены, их обсуждение существенно для понимания многих вопросов регуляции кроветворения и иммуногенеза человека.

Процесс апоптоза может быть разделен на 2 фазы:

• формирование и проведение апоптотических сигналов – фаза принятия решения;

• «демонтаж» клеточных структур – эффекторная фаза.

Рассмотрение цепочки апоптотических событий удобнее начать с завершающей стадии апоптоза.таблица1 Основные различия между видами клеточной смерти

Основными фигурантами эффекторной фазы апоптоза являются цистеиновые протеазы (каспазы). Каспазы расщепляют белки, являющиеся мишенями для их действия, характерным для апоптоза образом – в местах расположения аспарагиновых оснований. К настоящему времени у человека идентифицировано 14 видов каспаз, которые по своим функциональным особенностям могут быть разделены на 3 группы:

• активаторы цитокинов (каспазы-1, 4, 5, 13);

• каспазы-индукторы активации эффекторных каспаз (каспазы-2, 8, 9, 10);

• эффекторные каспазы-исполнители апоптоза (каспазы-3, 6, 7).

Каспазы находятся в клетках в неактивном состоянии (прокаспазы). Активация каспаз происходит путем их протеолитического расщепления в местах расположения аспарагиновых оснований с последующей димеризацией образованных таким образом активных субъединиц.

Эффекторные каспазы, будучи активированными, начинают цепь протеолитических событий, целью которых является апоптотический «демонтаж» клетки.

К ингибиторам эффекторных каспаз относятся белки семьи IAP, подавляющие активность каспаз-3 и 9. Интересно, что один из этих белков – Survin – обнаружен в клетках большинства злокачественных опухолей. С ним связывают резистент- ность опухолевых клеток к химиотерапии.

Исходя из ведущей роли каспаз в осуществлении клеточной смерти этого типа, апоптоз, с биохимической точки зрения, можно рассматривать как клеточную смерть, индуцированную каспазами.

Справедливости ради следует отметить, что каспазы, являясь основными эффекторами апоптоза, все же до конца не монополизируют эту клеточную активность. В ряде клеточных систем апоптоз может происходить и при инактивации каспаз, за счет активности других эффекторов, таких как активированные кальцием протеазы (например, кальпейн при индуцированном апоптозе лейкемических клеток), сериновые и лизосомальные протеазы, эндонуклеазы. Однако значение этих эффекторов в реализации апоптоза невелико и носит чаще всего дополнительный, компенсаторный характер.

Основная задача системы, регулирующей апоптоз, – держать эффекторные каспазы, демонтирующие клетки, в неактивном состоянии, но быстро переводить их в активную форму в ответ на минимальное действие соответствующих индукторов.

Функцию активации эффекторных каспаз берут на себя каспазы-индукторы, основными представителями которых являются каспаза-8 и каспаза-9.

Эти каспазы при обычном состоянии клетки неактивны, существуют в форме прокаспаз. Отсюда действие разнообразных проапоптотических сигналов направлено на активацию каспазы-8 и каспазы-9. В соответствии с этим выделяют 2 типа ведущих сигнальных путей:

1) повреждение ДНК, радиация, действие токсических агентов, действие глюкокортикоидов, прекращение цитокиновой регуляции, укорочение до критического уровня теломеров – активация каспазы-9;

2) проапоптотические сигналы, возникающие при активации рецепторов «региона клеточной смерти» (например, FasR, TNFR) – активация каспазы-8.

Повреждение ДНК вызывает активацию гена р53. Дальнейшее прохождение апоптотического сигнала этого типа происходит через активацию проапоптотических генов семьи Bcl-2 (Bax и Bid). Белки этих генов вызывают пермеабилизацию мембраны митохондрий и выход в цитозоль цитохрома C, аденозинтрифосфорной кислоты (dATP), апоптозиндуцирующего фактора (Aif) и ДНКазы. Цитохром C вместе с dATP активирует находящийся в цитозоле белок Apaf-1, образуя апоптосому, в которой происходит активация каспазы-9. Последняя активирует каспазу-3 – основной «экзекьютор» каспазного каскада. Вслед за этим активируются другие каспазы, протеазы и ДНКазы, происходит апоптоз. Высвобожденные из митохондрий Aif и ДНКаза выполняют дополнительный внекаспазный путь апоптоза, реализуют свою активность непосредственно в ядре.рис.2 Основные пути апоптоза. Объяснение в тексте

Связывание рецепторов «региона клеточной смерти» с соответствующими лигандами приводит к активации каспазы-8, способной к независимой активации каспазы-3. На этом пути может происходить и дополнительное вовлечение генов семьи Bcl-2 путем активации каспазой-8 белков гена Bid.

Модель апоптоза

Многое в регуляции апоптоза и в путях его реализации остается неясным.

При наличии столь сложных и консервативных путей генетической регуляции апоптоза он может происходить в клетках, лишенных ядра, в условиях ареста белкового синтеза, а также и в изолированных ядрах, находящихся вне клеток. Клетки могут подвергаться апоптозу в любой стадии клеточного цикла, при этом чувствительность их к апоптотическим стимулам различна.

Эти данные заставляют предположить, что отдельные компартменты клетки автономны в отношении апоптоза, а эффекторы его конституционально экспрессированы в каждой клетке, при этом контроль за их активностью может осуществляться с помощью как внутри-, так и внеклеточных сигналов.

Все это привело к созданию модели апоптоза, по которой каждая клетка при своем рождении как бы запрограммирована на самоуничтожение, условием жизни ее является блокирование этой суицидальной программы, осуществляемое постоянно или с небольшими интервалами.

К наиболее серьезным физиологическим ингибиторам апоптоза относятся ростовые факторы, экстрацеллюлярный матрикс, CD40-лиганд, нейтральные аминокислоты, цинк, эстрогены, андрогены. Механизм их действия неясен, его возможными путями могут быть снижение концентрации эффекторов апоптоза или снижение их активности до безвредного уровня, активация антиапоптотических факторов (например, гена Bcl-2). С этих позиций становится понятным особое значение связей клеток с экстрацеллюлярным матриксом, столь важное для функционирования нормального кроветворения.

Дифференцировка в нормальном кроветворении является стохастическим процессом, т.е. стволовые кроветворные клетки и клетки-предшественники осуществляют заложенную в их геном дифференцировочную программу автоматически при единственном условии – выживании, для чего необходимо воздействие на них антиапоптотических факторов. Самыми мощными антиапоптотическими стимулами для нормального кроветворения являются ростовые факторы. Ростовые факторы, наиболее активно участвующие в апоптозе клеток крови, их основные мишени и характер воздействия приведены в табл. 2.

Как следует из данных, представленных в табл. 2, большинство ростовых факторов, участвующих в кроветворении, препятствует апоптозу. При этом диапазон их действия широк, не ограничивается только клетками-предшественниками и пролиферирующими костно-мозговыми элементами, но простирается и на зрелые элементы, своим антиапоптотическим воздействием обеспечивая их выживание и нормальное функционирование (например, GM-CSF- и G-CSF-факторы, необходимые  для фагоцитоза нейтрофилов). Однако некоторые ростовые факторы оказывают амбивалентное действие в зависимости от воспринимающих их клеток-мишеней.Таблица 2 Ростовые факторы, вовлеченные в апоптоз

Действие большинства ростовых факторов происходит через специфические рецепторы или FasR и реализуется через семью Bcl-2 генов, индукция апоптоза может также происходить путем увеличения эндогенного уровня глюкокортикоидов – мощного проапоптотического фактора.

Регуляция апоптоза на генетическом уровне осуществляется в значительной мере посредством теломер-теламеразной активности клеток.

Теломерами называют концевые участки хромосом, состоящие из сотен повторяющихся, строго определенных нуклеотидных последовательностей (рис. 3). Эти последовательности, напоминающие «шапочки», надетые на концы хромо- сом, выполняют важную функцию в сохранении стабильности хромосом, предохраняя их от слияний, транслокаций и других поломок в процессе митоза. Из-за существования так называемых проблем концевой репликации ДНК, выражающихся в невозможности полного восстановления длины теломера при каждом ресинтезе ДНК, происходит его последовательное укорочение в процессе деления соматических клеток. Достижение теломером минимальной длины, способной защитить хромосомы от повреждения (2–5 kb), является сигналом для выхода клеток из митотического цикла с последующим включением апоптоза по первому сигнальному пути. Обычно для соматических клеток для этого требуется 60–80 удвоений. Исходя из этого, теломеры принято считать «биологическими часами» клетки, играющими ведущую роль в процессах старения.рис.3 Теломер. TTAGGG - концевые нуклеотидные повторы, составляющие теломер (тимин, аргинин, гуанин)

В табл. 3 приведены данные о средней длине теломеров кроветворных клеток различных иерархических уровней.

Таблица3 Длина теломеров kb в различных кроветворных клетокИз представленных данных следует, что наиболее длинные теломеры были выявлены в клетках тканей плода и новорожденных. В мононуклеарных и CD34+ -клетках периферической крови и костного мозга взрослых теломеры оказались значительно короче. В последние годы было показано, что укорочение теломеров в детском возрасте происходит значительно скорее чем у взрослых. Такие представления и дали основание считать теломеры «биологическими часами» клеток. Предполагается, что укорочение теломера является механизмом, определяющим число клеточных делений, предшествующих старению.

Противостоит этим событиям теломераза – рибонуклеопротеиновый энзим, который используется в качестве матрицы для синтеза TTAGGG последовательностей в концевых участках хромосом, препятствуя таким образом укорочению теломеров.

Теломераза – нормальный компонент зародышевых и самообновляющихся тканей, но в большинстве соматических клеток отсутствует или присутствует в редуцированном количестве, зато ее содержание оказывается высоким в большинстве опухолевых клеток.

Снижение или повышение способности клеток к апоптозу приводит к нарушению гомеостаза и может лежать в основе развития разнообразной патологии.рис.4 Нарушение клеточного равновесия при изменении уровня апоптоза.

Исследования последних лет показали, что патогенез многих болезней человека, в том числе рака, лейкозов, аутоиммунных болезней и вирусных инфекций, связан с неспособностью клеток подвергаться апоптозу. Другие болезни, такие как нейродегенеративные расстройства, СПИД, остеопороз, апластическая анемия и др. могут быть связаны, напротив, с повышенной способностью клеток к апоптозу. Графически влияние изменения скорости апоптоза на состояние клеточного равновесия представлено на рис. 4. Перечень заболеваний, связанных с торможением или индукцией апоптоза, приведен в табл. 4.Таблица 4 Болезни, связанные с торможением и усилением апоптоза

 

Роль апоптоза в развитии опухолевого роста

Снижение способности к апоптозу играет существенную роль в развитии многих опухолей, осуществляется это с помощью различных механизмов, анализ которых может быть полезен для понимания существующих и поиска новых путей подавления опухолевого роста.

Наиболее хорошо изученным механизмом подавления апоптоза, лежащего в основе наработки опухолевого клона, является аутокринное и паракринное повышение экспрессии к ним ростовых факторов и рецепторов, возникающее в опухолевых клетках вследствие активации онкогенов. Именно это свойство делает клетки опухолевого клона независимыми от микроокружения и лежит в основе их метастазирования.рис.5 Иммунная атака опухолевых клеток

Кроме того, мутация онкогена нередко сопровождается извращением его функции. Типичным примером такого механизма наработки опухолевого клона является хронический миелолейкоз, при котором транслокация t(9;22), известная под названием филадельфийской хромосомы, приводит к образованию химерного гена Bcr/Abl, продуктом которого является онкобелок, обладающий повышенной тирозинкиназной активностью и служащий важным звеном в передаче антиапоптотических сигналов в клетке. Механизм антиапоптотической активности этого онкопротеина расшифрован совсем недавно. В норме онкопротеин, кодируемый геном c-abl, участвует в реализации программы апоптоза во многих клеточных системах. Онкопротеин р210, кодируемый химерным геном Bcr/Abl при хроническом миелолейкозе, и онкопротеин р185, секретирующийся тем же химерным геном при остром лимфобластном лейкозе, обладают противоположной, антиапоптотической активностью – предохраняют клетки от облучения, цитотоксических препаратов и проапоптотических сигналов, возникающих при связывании Fas-рецептора. Осуществляется это путем блокирования Bax-гена и задержки выхода цитохрома С из митохондрий.

Другой пример – мутация онкогена c-myc. В норме экспрессия онкогена c-myc выражается в усилении пролиферации и в то же время способствует аресту клетки и апоптозу при прекращении действия на нее ростовых факторов. Такой физиологический механизм направлен на ограничение накопления пролиферирующих клеток. На модели мышиной лимфомы и опухолево-трансформированной линии фибробластов показано, что мутация c-myc в опухолевых клетках сопровождается разобщением этих функций, при этом c-myc-онкобелок отключает апоптоз в поврежденных пролиферирующих клетках, активируя ген Bcl-2, либо препятствуя активации Apaf-комплекса.

Другим механизмом поломки апоптоза в опухолевых клетках является мутация в генах, контролирующих суицидальную программу. В ряду этих процессов находится хорошо изученная оверэкспрессия гена Bcl-2, тормозящего апоптоз, что лежит в основе развития не только В-клеточной фолликулярной лимфомы человека, но и многих других опухолей.

Онкогенная трансформация клетки часто сопровождается мутацией в гене p53 и превращением его из индуктора в ингибитор апоптоза, что является во многих случаях ключевым механизмом в наработке опухолевого клона. Именно этот ген должен явиться сенсором множества сигналов, возникающих при наработке опухолевого клона и призванных включить апоптоз. К ним относятся: снижение поступления ростовых факторов; потеря межклеточных взаимодействий и связей с микроокружением; гипоксия вследствие недостаточного кровоснабжения; повреждение ДНК в результате мутаций и воздействия токсинов; укорочение теломера вследствие митогенного стресса и др. Все эти факторы должны включать апоптоз через посредство гене p53, как это было показано ранее. При снижении его активности или в результате патологической мутации этого не происходит, что лежит в основе накопления опухолевых клеток и дальнейшей опухолевой прогрессии. Мутация в гене p53 является также одним из факторов метастазирования опухоли, так как разрешает опухолевым клеткам длительно пребывать в суспензии без поддержки специфического микроокружения, что в норме должно было бы завершиться апоптозом.

Малоизученным, но не менее важным, как в понимании онкогенеза, так и в поисках новых путей коррекции его, является торможение апоптоза в результате нарушений его эффекторных механизмов и путей передачи проапоптотических сигналов. В этом отношении особый интерес представляет острый промиелоцитарный лейкоз (ОПЛ). Как показали исследования последних лет, в основе развития этой опухоли лежит транслокация t(15;17), в результате которой происходит слияние Pml-гена (хромосома 15) с рецептором гена ретиноевой кислоты (хромосома 17). Белок, являющийся продуктом Pml-гена, в норме модулирует как каспаззависимые, так и каспазнезависимые пути апоптоза, и потому его можно считать одной из центральных фигур апоптотического каскада. Необходимым условием осуществления проапоптотической функции Pml-белка является локализация его в специфических «крапчатых» ядерных структурах, по- лучивших название «ядерные тельца» (NB). При ОПЛ в результате транслокации t(15;17) происходят следующие события, приводящие к образованию опухолевого клона, резистентного к стандартной химиотерапии:

• выход Pml-белка из региона NB и потеря его проапоптотической функции;

• блокада синтеза ретиноевой кислоты, необходимой для дифференцировки клеток, в результате связывания химерным продуктом путей передачи транскрипционного сигнала гена ретиноевой кислоты.

Таким образом, особенностью патогенеза ОПЛ является сочетание торможения дифференцировки с блокированием апоптоза в клетках опухолевого клона. Значение ретиноевой кислоты и триокиси мышьяка в индукции ремиссии при ОПЛ связано с тем, что первый препарат вызывает клеточную дифференцировку, а второй – апоптоз, восстанавливая нормальную локализацию Pml-белка в NB.

Одним из ключевых моментов развития опухолевого процесса является ослабление противоопухолевого иммунного надзора. Известно, что в этих процессах активное участие принимают сами опухолевые клетки, секретируя растворимые иммуносупрессивные факторы и снижая иммуногенную активность экспрессированных на своей поверхности молекул главного комплекса гистосовместимости. Однако исследования последних лет выявили альтернативный механизм подавления опухолевыми клетками иммунного надзора, оказавшийся связанным с апоптозом.

Fas, также называемый CD95 или APO-1, является членом семьи рецепторов к TNF и широко распространен среди клеток разных видов, в том числе Т- и В-лифоцитов и некоторых опухолевых клеток. Связывание рецептора Fas с Fasлигандом (FasL) индуцирует апоптоз в экспрессирующих его клетках. FasL выделяется цитотоксическими Т-лимфоцита- ми и NK-клетками и является «фактором смерти», индуциру- ющим апоптоз в клетках-мишенях. Экспрессия FasL на клетках некоторых территорий (например, строме глаза или сертолиевых клетках яичек) немедленно убивает попавшие туда активированные клетки воспаления, обеспечивая тем самым запрет иммунных реакций на этих территориях. Эти данные побудили поиск экспрессии FasL на опухолевых клетках. Такой поиск увенчался успехом – FasL был выявлен в сыворотке больных с лейкозами и лимфомой, а также на клетках некоторых солидных опухолей. Лиганды Fas оказались функционально активны, так как были способны убивать клетки-мишени, экспрессирующие Fas-рецептор, при совместном культивировании. Эти данные явились основанием для создания гипотезы, по которой опухолевые клетки могут отражать иммунную атаку, убивая цитотоксические Т-лимфоциты и NK-клетки. При этом экспрессия Fas на опухолевых клетках часто бывает снижена и/или нарушен механизм реализации поступающих с этого рецептора проапоптотических сигналов. При экспрессии FasL на опухолевых клетках его растворимая форма может попадать в циркуляцию, провоцируя клетки, имеющие на своей поверхности Fas-рецептор, к апоптозу и тем самым вызывая мультиорганные поражения, часто наблюдаемые у онкологических больных. Схематично иммунная атака опухолевых клеток представлена на рис. 5.

Высокая активность теломеразы в опухолевых клетках также находится в ряду антиапоптотических факторов, лежащих в основе развития опухолевого роста. Особенное значение этот механизм имеет в патогенезе и патодинамике гемобластозов. Опухоли, исходящие из кроветворных клеток, характеризует сочетание высокой теломеразной активности при малом размере теломеров. Это приводит к продолжению деления опухолевых клеток и после укорочения теломеров ниже критических размеров, что, возможно, объясняет высокую генетическую нестабильность этих опухолей и большую предрасположенность к опухолевой прогрессии.

Апоптоз и противоопухолевая терапия

Исследования последних лет показали, что противоопухолевые препараты вызывают апоптоз, т.е. индуцируют самоубийство опухолевых клеток, используя те же пути, что и физиологические индукторы апоптоза: стимуляция гена p53, модуляция генов семьи Bcl-2, включение Fas-рецептора, активация эффекторных протеаз и эндонуклеаз, блокирование рецепторов антиапоптотических ростовых факторов и стимуляция проапоптотических. При этом многие опухоли сохраняют способность к апоптозу в ответ на те же стимулы, что и их нормальные аналоги. Этим объясняются успех антиандрогеновой терапии при раке предстательной железы и частая регрессия опухоли молочной железы при лечении антагонистами эстрогеновых рецепторов. Цитокины могут оказывать проапоптотическое действие и путем повышения уровня эндогенных глюкокортикоидов. При этом большие дозы препаратов (например, высокие дозы метотрексата) вызывают разрушение клеток путем некроза, что является значительно более токсичным для больного.

Хотя вид клеточной смерти зависит от концентрации препарата, в большей степени выбор остается за клетками. Иными словами, химиопрепараты вызывают апоптоз в клетках, готовых к нему.

Способность к спонтанному апоптозу лейкемических клеток ex vivo коррелирует с их лекарственной чувствительностью. Более того, получены убедительные данные, доказывающие, что наиболее благоприятное течение гипердиплоидных случаев острого лимфобластного лейкоза у детей (с числом хромосом более 51) связано с повышенной способностью этих клеток к спонтанному апоптозу и нечувствительностью к антиапоптотическому действию цитокинов в пробах ex vivo.

Для объяснения механизмов включения апоптоза химиопрепаратами можно воспользоваться гипотезой, по которой дефект, вызываемый ими в опухолевых клетках, считывается как инструкция к запуску апоптоза. В соответствии с этой гипотезой клеточная смерть, индуцированная химиопрепаратами, проходит 3 фазы (рис. 6):рис.6 Схема проапоптотического действия химиотерапии

1. Повреждение. В этой фазе каждый препарат, действуя на свои мишени (ДНК, РНК, микроканальцы и др.), вызывает их повреждение или дисфункцию.

2. Прохождение сигнала. В этой стадии клетка расшифровывает и оценивает полученное повреждение. Например, повреждение ДНК включает ген p53, следствием чего, как рассматривалось выше, является остановка клетки при прохождении митотического цикла и при невозможности репарации – апоптоз. Некоторые препараты, например доксорубицин, могут действовать в обход гена p53, вызывая апоптоз путем активации Fas-рецептора.

3. Индукция апоптоза. В этой фазе принимается окончательное решение и запускаются механизмы апоптоза в тех случаях, когда репарация невозможна. Нормальные клетки чаще принимают решение выйти из митотического цикла для дальнейшей репарации или дифференцировки. Такое решение раковые клетки принимают редко, значительно чаще выбирая в качестве альтернативы апоптоз.

Необходимо отметить высокую готовность к апоптозу кроветворной ткани и опухолей, исходящих из нее, что скорее всего объясняет лучшую эффективность химиотерапии при гемобластозах по сравнению с таковой при солидных опухолях. Способность клеток-предшественников кроветворной ткани человека к апоптозу находится в обратной зависимости от возраста, чем, вероятно, частично можно объяснить лучшую курабельность острых лейкозов у детей, чем у взрослых.

Несмотря на существенное улучшение результатов химиотерапии в онкологии, достигнутое в последние годы за счет повышения ее интенсивости и отработки методов сопроводительной терапии, в определенном проценте случаев развивается резистентность опухолевых клеток к химиопрепаратам, наиболее часто связанная с нарушением в них механизмов апоптоза. Это препятствует полной эрадикации опухоли и обрекает лечение на неудачу. Дальнейшее улучшение результатов химиотерапии в онкологии связано в значительной мере с преодолением этого препятствия.

Источник: ctvm.kz